[發明專利]ADAD2基因在制備檢測非梗阻性無精子癥診斷試劑盒中的應用

有效

• 申請號: 202210192293.2
• 申請日: 2022-02-28
• 公開（公告）號: CN114395621B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 張雨翔;姚晨成;田汝輝;白昊威;李錚
• 申請（專利權）人: 上海市第一人民醫院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 周春洪

本發明涉及一種非梗阻性無精子癥的檢測試劑盒，所述試劑盒包括檢測與非梗阻性無精子癥相關的遺傳標記的引物對，所述遺傳標記的核苷酸序列是ADAD2基因的序列，所述序列的突變位點選自c.C981G、p.F327L、c.1283?1GA中的一個或多個。本發明還提供了檢測試劑盒在診斷非梗阻性無精子癥的應用。以及ADAD2基因在制備檢測非梗阻性無精子癥診斷試劑盒中的應用。本發明提供了ADAD2基因的新的用途，從而提供了一種有效的進行非梗阻性無精子癥基因診斷、產前基因篩查及遺傳咨詢的途徑，應用效果表明本發明所提供的基因的SNP位點及檢測引物可以有效的用于臨床患者及胎兒絨毛或羊水進行ADAD2基因突變位點的快速檢測。

技術領域

本發明屬于醫學基因診斷領域，涉及遺傳病非梗阻性無精子癥的致病基因ADAD2突變位點及其在基因診斷中的應用。

背景技術

非梗阻性無精子癥(NOA)通常被認為是男性不育的一個非醫學可控制的原因。這些患者占所有不育男性的10％，他們的無精子癥的原因是精子發生異常。以卵胞漿內單精子注射(ICSI)為標準治療方式的體外受精技術的建立，使這些男性中的許多人通過手術從睪丸中取出精子成功地養育了一個孩子。

雙脫氧鏈終止法即Sanger測序：反應體系中包括目標DNA片段、脫氧三磷酸核苷酸(dNTP)、雙脫氧三磷酸核苷酸(ddNTP)、測序引物及DNA聚合酶等。測序反應的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基團，不具有與另一個dNTP連接形成磷酸二酯鍵的能力，這些ddNTP可用來中止DNA鏈的延伸。此外，這些ddNTP上連接有放射性同位素或熒光標記基團，因此可以被自動化的儀器或凝膠成像系統所檢測到。

早期基于Sanger法的測序設置了四個平行的測序反應，每一個反應中分別包括目標片段、DNA聚合酶、測序引物、四種dNTP和一種特定類型熒光(或放射性同位素)標記的ddNTP(即不同的反應中分別為ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP)。通過這樣的配置，在不同的反應中DNA鏈將會分別在A、G、C及T位中止，并形成不同長度的DNA片斷。這些片斷隨后可被凝膠電泳分開并顯示出來。變性丙烯酰胺電泳有四個泳道，每個泳道對應一種堿基。電泳結束后通過放射自顯影或紫外顯影可讀出X光片或凝膠影像。圖像中的每一個暗帶表示一個雙脫氧核苷酸(ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP)摻入后鏈終止的DNA片段的結果。四個泳道之間的不同暗帶的相對位置可以用來讀取(從底部到頂部)DNA序列，從而得到該目標片斷的堿基排列順序。隨著Sanger測序技術的發展，ddNTP的標記技術有了很大的提高。不同種類的ddNTP可以被不同熒光基團所標記，而這些熒光基團具有相同的激發波長和不同的發射波長，因而在光學上表現為不同的顏色。因此，測序反應可以在一個體系中進行，滿足了業界對測序速度、自動化及通量不斷提高的要求。

Sanger操作簡便，因此被廣泛使用，在其基礎上衍生出熒光自動測序技術等。基于熒光標記和雙脫氧鏈終止法的熒光自動測序儀被廣泛使用，用于人類基因組計劃等項目。基于毛細管電泳技術，Sanger測序現在已經可以在高度自動化的測序儀中進行，商用的產品包括Life?Technologies的3130xL、3730xL、3500Dx與3500Dx?xL測序儀及Beckman的GeXP遺傳分析系統等。這類系統最長可測定600-1000bp的DNA片段，且對重復序列和多聚序列的處理較好，序列準確性高。

中國專利文獻CN?105112501?A,公開了一種非梗阻性無精子癥的檢測試劑盒，包括檢測與非梗阻性無精子癥相關的遺傳標記的引物對，遺傳標記的核苷酸序列是DAX-1基因的序列，所述序列的突變位點選自c.152GA、c.312CG、c.725CT、c.766GC、c.1153GT、c.1279AG和c.162GA中的一個或多個；所述引物對選自primer?1、primer?2、primer?3或primer?4引物對。通過大規模測序在非梗阻性無精子癥病人中篩選出了DAX-1基因7個新的突變位點，研究表明DAX-1的上述突變可能導致非梗阻性無精子癥的發生，從而能夠通過使用本發明的試劑盒檢測該突變來實現對男性不育癥(尤其是非梗阻性無精子癥)的診斷檢測。