[發明專利]一種基于多交叉恒溫擴增和金納米生物傳感器

在審

• 申請號: 202210187640.2
• 申請日: 2022-02-28
• 公開（公告）號: CN114540548A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 王宇;余紅嵐;趙雪;郝家明
• 申請（專利權）人: 貴州安康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 重慶強大凱創專利代理事務所(普通合伙) 50217
• 代理人: 劉永來

本發明涉及生物醫藥檢測技術領域，具體涉及一種基于多交叉恒溫擴增和金納米生物傳感器的人類腸道病毒EVA71的檢測系統，包括用于擴增EVA71的PV1基因的多交叉恒溫擴增單元和檢測單元；所述多交叉恒溫擴增單元包括引物組合、鏈置換DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶緩沖液和MgSO₄等。檢測單元為金納米生物傳感器，本方案采用多交叉恒溫擴增結合金納米生物傳感器的方法。本方案不但有費用低廉和操作時間短的特點，而且它的檢測靈敏度更高，無需昂貴的PCR產物檢測儀器。本方案解決了現有的EVA71檢測方法成本高、耗時長、操作復雜和檢測靈敏度低等技術問題，將其應用在POCT等醫學檢測領域，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物醫藥檢測技術領域，具體涉及一種基于多交叉恒溫擴增和金納米生物傳感器的人類腸道病毒EVA71的檢測系統。

背景技術

目前對于腸道病毒EVA71的檢測的金標準主要依賴于傳統的病毒培養和中和試驗。該方法耗時大約5到7天，包括細胞培養，接種及后續的中和試驗，其劣勢是耗時耗力。隨著核酸診斷技術的快速發展，以PCR為基礎的診斷技術(如普通PCR技術，熒光PCR技術)被用于EVA71的檢測，然而這些方法依賴于昂貴的儀器設備以及探針合成，需要后續的電泳操作，且對操作人員的熟練程度有較高的要求。以PCR為基礎的診斷技術對于一些落后的實驗室無法進行，限制了這些技術的運用。并且目前運用這些檢測技術診斷腸道病毒EVA71的PCR方法和Real-time PCR方法，檢測過程耗時較長，不利于快速檢測和應急檢測。

為了克服PCR擴增技術的劣勢，近年來發展了許多恒溫擴增技術。恒溫擴增技術較PCR技術而言，不依賴于熱循環擴增設備，反應速度快，敏感性好。因此，恒溫擴增技術有利于實現快速擴增，便捷檢測及現場診斷。到目前為止，已發展的恒溫擴增技術有10余種，應用較為廣泛的有滾環擴增(RCA)、連置換擴增(SDA)、解旋酶依賴的恒溫擴增(HDA)、環介導恒溫擴增(LAMP)、交叉擴增(CPA)等。然而，這些恒溫技術實現核酸擴增需要多種酶同時工作，依賴于昂貴的試劑和復雜的操作步驟。因此這些方法的實用性，便捷性，可操作性有待于提高，尤其是在快速診斷領域及欠發達地區，上述恒溫擴增技術難以實施。亟需研發一種適合于人類腸道病毒EVA71檢測的基于恒溫擴增系統的、可有效降低成本和提升檢測便捷程度的快速檢測技術。

發明內容

本發明的目的在于一種基于多交叉恒溫擴增和金納米生物傳感器的人類腸道病毒EVA71的檢測系統，用以解決現有的檢測方法成本高、耗時長、操作復雜和檢測靈敏度低等技術問題。

為解決上述技術問題，本發明技術方案如下：

一種基于多交叉恒溫擴增和金納米生物傳感器的人類腸道病毒EVA71的檢測系統，包括用于擴增EVA71的PV1基因的多交叉恒溫擴增單元；所述多交叉恒溫擴增單元包括引物組合；所述引物組合包括置換引物、交叉內引物和擴增引物；所述置換引物包括序列如SEQ ID NO:1所示的F1和序列如SEQ ID NO:2所示的F2；所述交叉內引物包括序列如SEQ IDNO:3所示的CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的CP2；所述擴增引物包括序列如SEQ ID NO:5所示的C1和序列如SEQ ID NO:6所示的C2、序列如SEQ ID NO:7所示的D1和序列如SEQ ID NO:8所示的D2以及序列如SEQ ID NO:9所示的R1和序列如SEQ ID NO:10所示的R2。

采用上述技術方案，技術原理為：

本技術方案使用多交叉恒溫擴增單元對待測樣本中的EVA71的PV1基因進行擴增，擴大目的片段的拷貝數，便于進行后續的PV1基因的檢測，進而診斷是否存在EVA71感染。本方案使用到了多交叉置換擴增(Multiple cross displacement amplification，MCDA)技術，能夠在恒溫條件下實現靶序列擴增。采用本方法對EVA71病毒的目的基因進行擴增，對設備的要求低且擴增效率高，具有擴增速度快、反應靈敏、特異性高等優點。這也是首次將該項技術應用在EVA71病毒的檢測的實踐操作中。