[發(fā)明專(zhuān)利]一種產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的枯草芽孢桿菌重組菌的構(gòu)建及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210183889.6
• 申請(qǐng)日: 2022-02-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114774336A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-07-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 康春濤;朱枝群;陳勝玲;張曉霞
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江蘇星海生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/75;C12N15/54;C12N15/53;C12P13/08;A23K20/142;C12R1/125
• 代理公司: 北京卓嵐智財(cái)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 沈煜華

1.代謝工程改造枯草芽孢桿菌促進(jìn)L-賴(lài)氨酸的合成，其特征在于，所述的重組菌以益生菌B.subtilis ACCC11025為宿主，將B.subtilis中thrD、zwf和gnd用來(lái)源C.glutamicum中l(wèi)ysC³¹¹、zwf²⁴³和gnd³⁶¹替換，且B.subtilis中hom替換成來(lái)源C.glutamicum中hom⁵⁹，最后再引入C.glutamicum中DapDH改變二氨基庚二酸途徑碳分布而促進(jìn)L-賴(lài)氨酸的合成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌重組菌，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌包括B.subtilis XH0、B.subtilis XH1、B.subtilis XH2、B.subtilis XH3、B.subtilis XH4、B.subtilisXH5或B.subtilis XH6。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌重組菌，其特征在于，所述的編碼天冬氨酸激酶的基因lysC³¹¹來(lái)源于C.glutamicum，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌重組菌，其特征在于，所述的編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的基因zwf²⁴³來(lái)源于C.glutamicum，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌重組菌，其特征在于，所述的編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因gnd³⁶¹來(lái)源于C.glutamicum，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌重組菌，其特征在于，所述編碼高絲氨酸脫氫酶的hom⁵⁹來(lái)源于C.glutamicum，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌重組菌，其特征在于，所述的編碼二氨基庚二酸脫氫酶基因ddh來(lái)源于C.glutamicum，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

8.一種權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)天冬氨酸激酶基因lysC、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因zwf、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因gnd和高絲氨酸脫氫酶基因hom的替換，以及異源表達(dá)DapDH基因ddh：以枯草芽孢桿菌ACCC11025為宿主，采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)將基因thrD、zwf、gnd和hom替換為來(lái)源于C.glutamicum的lysC³¹¹、zwf²⁴³、gnd³⁶¹和hom⁵⁹，再異源引入C.glutamicum的DapDH基因ddh。

(2)重組質(zhì)粒構(gòu)建：以釀膿鏈球菌的基因組作為模板，將基因Spcas9進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后利用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pHT01和片段Spcas9進(jìn)行雙酶切并酶連，獲得目標(biāo)重組質(zhì)粒pHT01-Cas9。再將B.subtilis的thrD、zwf、gnd、hom和pksD基因的sgRNA無(wú)縫連接到質(zhì)粒pBE980b，獲得五個(gè)帶有靶向位點(diǎn)的質(zhì)粒。再將C.glutamicum的lysC³¹¹基因、zwf²⁴³基因、gnd³⁶¹基因、hom⁵⁹基因和ddh基因與B.subtilis的thrD、zwf、gnd、hom和pksD基因的上下同源臂通過(guò)融合PCR進(jìn)行基因融合，再依次酶切連接至質(zhì)粒pBE980b后得到重組質(zhì)粒。

(3)重組菌構(gòu)建：將重組質(zhì)粒pHT01-Cas9電轉(zhuǎn)至B.subtilisACCC11025感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)氨芐抗性篩選得到帶有Cas9蛋白的轉(zhuǎn)化子。再將其余重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至帶有Cas9蛋白的B.subtilis ACCC11025感受態(tài)細(xì)胞中，篩選得到所述的重組菌。