[發(fā)明專(zhuān)利]一種ARHGAP11B基因缺失的iPSC細(xì)胞系的構(gòu)建方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210183615.7
• 申請(qǐng)日: 2022-02-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114457080A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周小青;劉玉;陳濤;金銀戈;鄭偉;鄒慶劍;唐成程;陳敏;程令印;鄭雨齡;鄭淑文;郭素琴;徐巨才;陳靜;賴(lài)良學(xué)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 五邑大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/113
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10;C12N15/65;C12N15/12;C12R1/91
• 代理公司: 廣州三環(huán)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 柯夢(mèng)云

1.用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特異性sgRNA，其特征在于，所述sgRNA在人ARHGAP11B基因的靶向位點(diǎn)位于人ARHGAP11B基因的6號(hào)外顯子上；所述sgRNA對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為以下情況的至少一種：

a)sgRNA1：

gcgtgtaccagactttatcc；

b)sgRNA2：

ggaaaagataccagccatgt；

c)sgRNA3：

gactttatcctggaaaagat。

2.一種CRISPR/Cas9載體，其特征在于，所述CRISPR/Cas9載體包括權(quán)利要求1所述的用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特異性sgRNA。

3.如權(quán)利要求2所述的CRISPR/Cas9載體，其特征在于，所述CRISPR/Cas9載體由質(zhì)粒px458-exon6和質(zhì)粒pCEP4-middle酶切后，帶入權(quán)利要求1所述的用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特異性sgRNA、抗性基因Puro和GFP熒光蛋白基因。

4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包括權(quán)利要求2或3所述的CRISPR/Cas9載體。

5.一種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除iPSC細(xì)胞系中ARHGAP11B基因的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、將權(quán)利要求2或3所述的CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)染iPSC，培養(yǎng)，通過(guò)嘌呤霉素篩選成功轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性iPSC；

S2、對(duì)成功轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性iPSC進(jìn)行多能性鑒定。

6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟S1中轉(zhuǎn)染為采用BEX CUY2EDITⅡ轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的電轉(zhuǎn)。

7.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S1轉(zhuǎn)染結(jié)束后，將iPSC加入到含10％CloneRTM的mTeSR^TM1培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

8.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法還包括對(duì)陽(yáng)性iPSC進(jìn)行PCR鑒定的步驟，PCR鑒定中的引物如SEQ ID NO:5～6所示。

9.如權(quán)利要求5～8任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法獲得的iPSC細(xì)胞系。

10.如權(quán)利要求9所述的iPSC細(xì)胞系在建立ARHGAP11B基因敲除的體外細(xì)胞模型中的應(yīng)用。