[發(fā)明專利]磁珠輔助的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)miRNA的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210181781.3
• 申請(qǐng)日: 2022-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN115820814A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃晉;劉振翔;石慧;王柯敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6844
• 分類號(hào): C12Q1/6844
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務(wù)所(普通合伙) 43008
• 代理人: 陳暉

本發(fā)明公開了一種磁珠輔助的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)miRNA的方法，包括以下步驟：將HP探針偶聯(lián)至鏈霉親和素包被的磁珠表面；將磁珠修飾的HP探針、靶標(biāo)Target、靶標(biāo)miRNA序列混合形成反應(yīng)體系，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；收集修飾的磁珠的熒光信號(hào)。本發(fā)明提供的一種磁珠輔助的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)miRNA的方法，該方法利用磁珠將待檢測(cè)靶標(biāo)從復(fù)雜環(huán)境中分離，利用等溫?cái)U(kuò)增實(shí)現(xiàn)miRNA的循環(huán)，實(shí)現(xiàn)miRNA的放大檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種磁珠輔助的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)miRNA的方法。

背景技術(shù)

生物標(biāo)志物(Biomarker)是一種生化指標(biāo)，它的改變可以表示系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)或功能的變化或可能產(chǎn)生的變化。對(duì)于生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，可以反映人生理過程的改變，從而對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷；可以得出所使用的藥物對(duì)疾病的干預(yù)程度以及在藥物靶點(diǎn)確定等方面進(jìn)行應(yīng)用。生物標(biāo)志的種類較多，常見的生物標(biāo)志物有蛋白質(zhì)、核酸等。

MicroRNA，是一種長度為19～24個(gè)左右核苷酸的小RNA。它可以通過與信使RNA結(jié)合來調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，從而作用于mRNA，抑制其翻譯等。因此，對(duì)生物的生理過程有著重要的影響。研究表明，miRNA的異常表達(dá)與多種癌癥的產(chǎn)生與發(fā)展相關(guān)，可用作癌癥的疾病標(biāo)志物，用于癌癥的檢測(cè)與診治。但它們通常以較低的豐度存在于細(xì)胞、外泌體或體液等復(fù)雜樣品中，因此其檢測(cè)面臨著“能否測(cè)得到”和“能否測(cè)得準(zhǔn)”的問題。

因此為了保證復(fù)雜樣品檢測(cè)的順利進(jìn)行，需要將目標(biāo)物與其他干擾組分分離。常見的復(fù)雜生物樣品的分離方式包括磁分離、色譜分離、毛細(xì)管電泳分離等。磁珠中由于具有較高的磁鐵含量，與外部磁場(chǎng)響應(yīng)速度快；可以在磁珠表面進(jìn)行生物修飾從而與多種待測(cè)物結(jié)合以及操作簡單等特點(diǎn)，在樣品處理和生物分析檢測(cè)等方面應(yīng)用廣泛。

miRNA的長度極短、含量極低和序列同源性高，在檢測(cè)中提出了巨大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)是定量PCR(qPCR)，但它需要復(fù)雜的反應(yīng)程序和特定的儀器。而等溫?cái)U(kuò)增已經(jīng)成為用于miRNA檢測(cè)的一種強(qiáng)大的核酸定量方法，與PCR相比，等溫?cái)U(kuò)增無需精確控制溫度循環(huán)即可進(jìn)行，可以在簡單的條件下快速有效地?cái)U(kuò)增目標(biāo)核酸或識(shí)別信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對(duì)miRNA存在豐度低及其他物質(zhì)干擾問題，提供的一種磁珠輔助的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)miRNA的方法，該方法利用磁珠將待檢測(cè)靶標(biāo)從復(fù)雜環(huán)境中分離，利用等溫?cái)U(kuò)增實(shí)現(xiàn)miRNA的循環(huán)，實(shí)現(xiàn)miRNA的放大檢測(cè)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種磁珠輔助的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)miRNA的方法，包括以下步驟：

S1、將HP探針偶聯(lián)至鏈霉親和素包被的磁珠表面；

S2、將磁珠修飾的HP探針、靶標(biāo)Target、靶標(biāo)miRNA序列混合形成反應(yīng)體系，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；

S3、收集修飾的磁珠的熒光信號(hào)。

上述的方法，進(jìn)一步的，所述HP探針的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

上述的方法，進(jìn)一步的，所述HP探針采用可以與鏈霉親和素包被的磁珠偶聯(lián)的生物素修飾。

上述的方法，進(jìn)一步的，所述HP探針中間修飾有FAM熒光基團(tuán)和BHQ淬滅基團(tuán)。

上述的方法，進(jìn)一步的，所述靶標(biāo)Target序列的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

上述的方法，進(jìn)一步的，所述S2中所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為：

在37℃下分別孵育150～240min。

上述的方法，進(jìn)一步的，所述S3中，收集修飾的磁珠的熒光信號(hào)，設(shè)置激發(fā)波長為488nM，收集波長范圍為505～525nm，收集磁珠的熒光信號(hào)。