[發(fā)明專利]一種愈傷組織特異啟動子Pcsp及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210181702.9
• 申請日: 2022-02-25
• 公開（公告）號: CN114657179B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚健韜;祝欽瀧;劉耀光;郭晶心;羅婉妮
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/65;C12N15/55;A01H6/46;A01H5/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 孫鳳俠

本發(fā)明提供了一種愈傷組織特異強(qiáng)啟動子Pcsp，涉及植物生物技術(shù)及基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明成功分離并克隆了一種愈傷組織特異強(qiáng)啟動子Pcsp，克服了現(xiàn)有技術(shù)利用組成型啟動子驅(qū)動標(biāo)記基因，表達(dá)活性不高或特異性較低的不足。本發(fā)明還提供了在本啟動子Pcsp的應(yīng)用。該P(yáng)csp啟動子可以用來構(gòu)建植物遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯載體，可以驅(qū)動標(biāo)記基因、Cas核酸酶編碼基因或特定功能基因在愈傷組織中特異高水平表達(dá)，表達(dá)水平約為組成型啟動子P35S所驅(qū)動GUS的4倍；不影響轉(zhuǎn)基因陽性植株正常生長的情況下，在植株組織器官中不表達(dá)，具有特異性，更安全，可解決生物安全方面的擔(dān)憂；在基因編輯實(shí)驗(yàn)中周期短、成本低、靈敏度高，在植物遺傳轉(zhuǎn)化和基因工程領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)及植物基因工程領(lǐng)域。更具體地，涉及一種愈傷組織特異強(qiáng)啟動子Pcsp(callus-specific promoter)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

啟動子按照作用方式及功能一般分為組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子，啟動子在遺傳轉(zhuǎn)化時，即將外源基因轉(zhuǎn)入植物外植體中表達(dá)過程中時，對導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和特異性有重要作用。相較于組成型啟動子，組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子能夠在特定的時期和組織中積累基因表達(dá)產(chǎn)物，同時可顯著減輕其對植物生長發(fā)育可能產(chǎn)生的干擾等負(fù)面影響。因此，組織特異性啟動子因其安全性已被廣泛的研究和使用，如使用胚乳特異性啟動子PGt1或PGluB4在水稻胚乳中積累β-胡蘿卜素或蝦青素(Paine,etal.2015.Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content.Nature Biotechnology.23,482-487；Zhu,et al.2018.From GoldenRice to aSTARice:Bioengineering Astaxanthin Biosynthesis in RiceEndosperm.Molecular plant.11,1440-1448.)；使用花藥特異啟動子PV4在水稻花藥組織中提出篩選標(biāo)記基因(Zhu,et al.2017.Development ofPurple Endosperm Rice”byEngineering Anthocyanin Biosynthesis in the Endosperm with a High-EfficiencyTransgene Stacking System.Molecular Plant.10,918-929.)；利用卵細(xì)胞特異性啟動子PDD45驅(qū)動水稻胚胎發(fā)生基因BBM1的異位表達(dá)，使水稻產(chǎn)生孤雌生殖并得到了無性繁殖的克隆種子(Khanday,et al.2019.A male-expressed rice embryogenic triggerredirected for asexual propagation through seeds.Nature.565,91-95.)。

為了高效地從大量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選到陽性遺傳轉(zhuǎn)化子，通常需要使用強(qiáng)啟動子來確保足夠高的篩選標(biāo)記基因表達(dá)水平，對于組織特異性啟動子一般在高效性上存在不足，而組成型啟動子如P35S和PUbi由于與RNA聚合酶具有更強(qiáng)的親和力常被用作高效驅(qū)動標(biāo)記基因表達(dá)，但越來越多的研究表明，組成型表達(dá)標(biāo)記基因可能會產(chǎn)生細(xì)胞毒性并阻礙植株的正常生長發(fā)育，也引起了人們對篩選標(biāo)記基因在生物安全方面的擔(dān)憂。為了解決上述問題，人們發(fā)現(xiàn)愈傷組織作為植物轉(zhuǎn)化中最常用的外植體(愈傷組織)，是一種快速研究特定基因功能與進(jìn)行基因編輯實(shí)驗(yàn)的良好對象，通過將功能基因或Cas核酸酶編碼基因在愈傷組織細(xì)胞系研究平臺中表達(dá)，其具有高效、周期短和成本低等優(yōu)點(diǎn)。此外，某些基因，如促進(jìn)細(xì)胞分化再生的基因，雖然適合在愈傷組織中表達(dá)，但在植物中持續(xù)表達(dá)則會影響植株的正常生長。而上述問題可通過使用一種在愈傷組織中特異表達(dá)的啟動子驅(qū)動標(biāo)記基因、Cas核酸酶編碼基因或特定功能基因在愈傷組織中特異性高表達(dá)積累而解決。