[發明專利]一種PDL1的適配體功能化SERS探針的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202210181663.2
• 申請日: 2022-02-25
• 公開（公告）號: CN114544941A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 黃青;穆罕默德;劉超
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/68;G01N21/65
• 代理公司: 合肥市浩智運專利代理事務所(普通合伙) 34124
• 代理人: 葉濛濛

1.一種PDL1的適配體功能化SERS探針的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1、制備CD63探針

S1-1、磁性復合材料Au/TiO₂/Fe₃O₄的制備

a.制備Fe₃O₄納米球：在磁力攪拌下，將FeCl₃·6H₂O、檸檬酸三鈉和NaAc(醋酸鈉)完全溶解在乙二醇中，然后將上述混合物轉移到高壓釜中加熱，對得到的黑色產物進行洗滌、密封干燥，得到Fe₃O₄納米球；

b.修飾Fe₃O₄納米球：將干燥的Fe₃O₄納米球和氨水溶解在乙醇中，加熱并攪拌上述混合物，同時將稀釋在乙醇中的TBOT(鈦酸四丁酯)滴加到混合物中，待混合物降至室溫，繼續攪拌20-28小時；

對攪拌產物進行洗滌、干燥，在超聲水浴下將干燥產物溶解在乙醇中，然后添加APTMS(3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)并再次超聲處理；將上述混合溶液加熱回流，并對回流產物進行洗滌，再分散在乙醇中得到修飾Fe₃O₄納米球；

c.制備Au/TiO₂/Fe₃O₄納米球：調節修飾Fe₃O₄納米球的pH至4.5-5.5，攪拌的同時將經過APTMS穩定的TiO₂/Fe₃O₄納米球添加到Au納米顆粒中，并繼續攪拌15-25分鐘；使用外磁場分離，對獲得的產物進行洗滌并溶解在水中，得到Au/TiO₂/Fe₃O₄納米球；

S1-2、適配體修飾CD63探針

將硫醇化的CD63適配體溶解在無核酸酶的水中，并在93-98℃的水浴中加熱10-15分鐘，隨后立即浸入冰水浴中25-35分鐘；再將TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述CD63適配體溶液中，使CD63適配體脫鹽；然后將混合物在室溫下孵育1.5-2.5小時，并用無核酸酶的水洗滌；

將等體積的脫鹽CD63適配體溶液與Au/TiO₂/Fe₃O₄納米球混合，并在3.5-4.5℃下孵育8-10小時；使用外部磁場分離，將收集產物用無核酸酶水洗滌，并與MCH(平均紅細胞血紅蛋白量)再次在3.5-4.5℃下孵育1.5-2.5小時，最后對孵育產物再次洗滌得到適配體修飾CD63探針，并在3.5-4.5℃溫度下儲存；

S2、制備PDL1探針

S2-1、Ag/4-ATP/Au SERS標簽的制備

配制0.01-0.02mol/L的4-ATP水溶液，并在3.5-4.5℃下儲存4-5小時；

將4-ATP添加到Au納米顆粒中，并對混合物進行磁力攪拌，而后將混合溶液在3.5-4.5℃下孵育4-5小時并用去離子水洗滌；

然后將抗壞血酸添加到4-ATP功能化的Au納米球中，逐滴添加AgNO₃，當溶液顏色從紅色變為淺橙色時，停止攪拌并用去離子水洗滌產物，得到Ag/4-ATP/Au SERS標簽。

S2-2、適配體修飾的PDL1探針

將硫醇化的PDL1適配體溶液溶解在無核酸酶的水中，并在90-100℃的水浴中加熱10-15分鐘，隨后立即浸入冰水浴中25-30分鐘；再將TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶解到上述PDL1適配體溶液中，使PDL1適配體脫鹽；然后將混合物在室溫下孵育1.5-2.5小時，并用無核酸酶的水洗滌；

將等體積的脫鹽PDL1適配體溶液與Ag/4-ATP/Au SERS標簽混合，并在3.5-4.5℃下孵育8-10小時；對孵育產物進行離心，并用無核酸酶水洗滌；然后將洗滌后的溶液與MCH(平均紅細胞血紅蛋白量)在3.5-4.5℃下混合1.5-2.5小時，同時進行離心；最后對孵育產物再次洗滌，得到適配體修飾PDL1探針，并在3.5-4.5℃溫度下儲存。