[發明專利]一種長效化艾塞那肽的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202210172681.4
• 申請日: 2022-02-24
• 公開（公告）號: CN114456276A
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 高國生;李建輝;蔡挺;張嫦珍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大學寧波華美醫院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C07K1/22;C07K1/36;C07K1/34;A61K38/22;A61K47/64;A61K47/65;A61P3/08;A61P3/10;A23L33/18;C12R1/19
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• 代理人: 張強

本發明公開了一種長效化艾塞那肽的制備方法及其應用，屬于藥物肽制備技術領域。本發明長效化艾塞那肽的制備過程包括：將艾塞那肽的序列融合構建到DARPin的N端，艾塞那肽與DARPin之間使用5個甘氨酸作為linker將艾塞那肽?(Gly)₅?DARPin使用微生物進行表達，收集微生物純化即得長效化艾塞那肽。制得的長效化艾塞那肽能夠在低劑量的情況下，長時間有效降低血糖濃度。

技術領域

本發明涉及藥物肽制備技術領域，具體涉及一種長效化艾塞那肽的制備方法及其應用。

背景技術

艾塞那肽是一種胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，序列為：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂。

艾塞那肽主要用于治療II型糖尿病。艾塞那肽具有GLP-1受體激動劑作用，在分子結構、生物活性、作用靶點及免疫原性等方面與GLP-1相似。艾塞那肽的分子結構與GLP-1的同源性達53％，結構差異表現在：C端多出9個氨基酸，不易被肽鏈內切酶降解；N端第二個氨基酸為甘氨酸，不會被二肽基肽酶IV(DPP-IV)分解。特殊的分子結構使艾塞那肽在血漿中的半衰期長達9.57小時，患者每天注射兩次且低血糖發生風險小，當血糖升高時，艾塞那肽能夠升高細胞內cAMP，誘導胰島素釋放；當血糖降低時，其誘導胰島素釋放的作用即會消退。然而，由于蛋白質/多肽類藥物普遍存在體內半衰期較短，物理、化學穩定性較差，易被體內各種蛋白酶降解等特性，使得這些藥物通常需要在一天之內多次注射，這給病人帶來了許多痛苦和諸多不便。

現有技術中公布了很多制備艾塞那肽的方法以及延長艾塞那肽半衰期的方法，例如CN102532303A公開了使用甲氧基聚乙二醇殘基與艾塞那肽分子中賴氨酸殘基的氨基或N末端組氨酸殘基的氨基綴合，合成聚乙二醇(PEG)綴合的艾塞那肽的方法；CN101980725A公開了脂肪酸-PEG-艾塞那肽的結構，并且PEG的修飾位點在N端His上。然而，使用PEG的缺點在于不能形成均一的產物；使用脂肪酸鏈修飾的鏈接的缺點在于工藝復雜，成本較高。需開發新的艾塞那肽衍生物，使其在體內作用時間長，穩定性好，降糖效果好，同時保持低毒性和較好的活性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種半衰期長的長效化艾塞那肽的制備方法；本發明的另一個目的在于提供一種能夠作為藥物載體用于制備長效化艾塞那肽的DARPin蛋白。

為達到上述發明目的，采用如下技術方案：

一種長效化艾塞那肽的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：設計長效化艾塞那肽序列，序列中包含DARPin序列；

步驟2：表達和純化長效化艾塞那肽；

其中DARPin的序列如SEQIDNO.1所示。

DARPin作為藥物載體，用于提高艾塞那肽在體內的半衰期，以提高艾塞那肽降血糖能力。

優選地，步驟1中長效化艾塞那肽的結構為6His-酶切位點-艾塞那肽-Linker-DARPin；

其中，6His為組氨酸純化標簽，其氨基酸序列為His-His-His-His-His-His；

Linker為連接肽，其氨基酸序列為：Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；

艾塞那肽氨基酸序列為：