[發(fā)明專利]Spag6在制備緩解缺血性腦卒中再灌注介導的突觸損傷藥物中的應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210169826.5
• 申請日: 2022-02-23
• 公開（公告）號: CN114470159A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設計）人: 曹曉璐;胡一鳴;張玲;柳赟昊;石玉琴;付國慶;周婷;全超
• 申請（專利權）人: 武漢科技大學
• 主分類號: A61K38/17
• 分類號: A61K38/17;A61K48/00;A61P9/10;C12N15/867;C12N15/12;C12N7/01
• 代理公司: 湖北創(chuàng)融藍圖知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 42276
• 代理人: 陳沖

1.Spag6在制備緩解缺血性腦卒中再灌注介導的突觸損傷藥物中的應用。

2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于：

所述的藥物的活性成分為含有Spag6編碼基因的慢病毒或腺病毒載體。

3.根據(jù)權利要求2所述的慢病毒載體，其特征在于：

所述慢病毒載體采用CV186質粒，且具有Ubi-MCS-3FLAG-SV40-Cherry-IRES-puromycin基因結構。

4.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于：

所述藥物為無菌注射溶液形式的劑型。

5.一種制備表達Spag6的慢病毒載體的方法，步驟如下：

(1)將Spag6基因插入到CV186質粒上，構建Spag6過表達質粒：提取Hela細胞RNA，逆轉錄得cDNA，設計Spag6引物：

Spag6l(59908-1)-p1：

AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGCCAGCGGCAGGTGCTTC，

Spag6l(59908-1)-p2：TCCTTGTAGTCCATACCGGTCTGTGGCTGGTAGCTGTCCACCC，

PCR克隆目的基因Spag6，并進行電泳、割膠純化，用BamHI/AgeI對克隆的目的基因Spag6進行雙酶切得到目的基因片段，質粒載體CV186雙酶切后回收線性化的載體片段，目的基因片段與線性化的載體片段連接后轉化E.coli感受態(tài)細胞，用菌落PCR鑒定轉化子，陽性克隆送測序，測序無誤的克隆進行質粒抽提，命名為KL59908-1；

(2)將Spag6基因整合到慢病毒載體上，構建Spag6過表達慢病毒

Spag6過表達載體構建：用抽提得到的KL59908-1質粒，轉化E.coli感受態(tài)細胞，進行大量克隆，并抽提KL59908-1質粒，用于慢病毒包裝；

慢病毒包裝：將攜帶Spag6的載體質粒KL59908-1與慢病毒包裝質粒pHelper1.0以及pHelper2.0共轉染293T細胞，以質量比3:2:1混合，在細胞內(nèi)發(fā)生同源重組，形成攜帶Spag6基因的重組慢病毒，命名為LV-Spag6l(59908-1)，經(jīng)擴增、純化、滴度測定獲得2×10⁸IU/ml高滴度的Spag6過表達慢病毒。