[發明專利]一種基于RPA的光電化學傳感器的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 202210168117.5
• 申請日: 2022-02-23
• 公開（公告）號: CN114540515B
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發明（設計）人: 陳曉梅;戈瑞;魏潔;陳全勝
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12Q1/00
• 代理公司: 廈門福貝知識產權代理事務所(普通合伙) 35235
• 代理人: 陳遠洋

1.一種基于RPA的光電化學傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟S1：將氨基功能化Bi₂S₃(NH₂-Bi₂S₃)溶于無酶水，得到懸浮液A；將羧基功能化大腸桿菌O157：H7反向引物溶于磷酸鹽緩沖溶液，得到溶液B；將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于磷酸鹽緩沖溶液中，得到溶液C；

步驟S2：將所述懸浮液A、所述溶液B和所述溶液C混合反應得到懸浮液D；

步驟S3：所述懸浮液D用所述磷酸鹽緩沖液洗滌離心后去除未連接引物，然后分散于含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖溶液中，得到目標產物Bi₂S₃-AR；

步驟S4：在紙基絲網印刷電極(SPPE)表面生長金納米粒子(AuNPs)，得到目標工作電極AuNPs/SPPE；

步驟S5：將巰基功能化大腸桿菌O157：H7正向引物溶于磷酸鹽緩沖溶液，得到溶液E，將所述溶液E滴在所述工作電極AuNPs/SPPE表面進行孵育，孵育結束后，用巰基乙醇(MCH)溶液沖洗，得到目標產物AF/AuNPs/SPPE；

步驟S6：用細菌DNA提取試劑盒對大腸桿菌O157：H7的基因組DNA(gDNA)進行提取，得到大腸桿菌O157：H7gDNA，產物作為模板參與后續RPA擴增；

步驟S7：將所述Bi₂S₃-AR、所述大腸桿菌O157：H7gDNA、無核酸酶水、Rehy-drationBuffer和大腸桿菌O157：H7溶液正向引物加入到凍干粉試劑管內混合均勻得到混合溶液，將所述混合溶液轉移至所述AF/AuNPs/SPPE表面，然后滴入醋酸鎂溶液，反復抽吸開啟不對稱RPA反應，反應結束后，用所述巰基乙醇(MCH)溶液沖洗電極，得到目標產物Bi₂S₃-DNA-AuNPs/SPPE。

2.根據權利要求1所述的基于RPA的光電化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖溶液的物質的量濃度為10mmol/L，pH值為7.4。

3.根據權利要求1所述的基于RPA的光電化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中的所述懸浮液A、所述溶液B和所述溶液C混合后，在恒溫培養搖床中的反應溫度為25℃、反應轉速為120rpm以及反應時間為2h。

4.根據權利要求1所述的基于RPA的光電化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟S5中的所述巰基功能化大腸桿菌O157：H7正向引物溶于所述磷酸鹽緩沖溶液的物質的量濃度為2μmol/L。

5.根據權利要求1所述的基于RPA的光電化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟S5中的所述溶液E滴在所述工作電極AuNPs/SPPE表面在4℃下孵育16h。

6.根據權利要求1所述的基于RPA的光電化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟S7中的所述大腸桿菌O157：H7溶液正向引物的物質的量濃度為10fmol/L～100pmol/L。

7.根據權利要求1所述的基于RPA的光電化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟S7中的所述Bi₂S₃-AR添加量為4μL。

8.一種根據權利要求1-7任一項所述的方法制備光電化學傳感器。

9.根據權利要求1所述的光電化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述Bi₂S₃-DNA-AuNPs/SPPE為工作電極，將pH值為4～9的磷酸緩沖溶液作為微型電解液滴加于所述工作電極，所述磷酸緩沖溶液的物質的量濃度為0.05mol/L，所述大腸桿菌O157：H7gDNA的濃度為10⁰～10¹²copies/mL。