[發明專利]肺泡灌洗液樣本微生物宏基因組的提取及文庫構建方法

在審

• 申請號: 202210166927.7
• 申請日: 2022-02-23
• 公開（公告）號: CN114395615A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 徐君南;趙毅;曲明星
• 申請（專利權）人: 遼寧康惠生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 大連星海專利事務所有限公司 21208
• 代理人: 楊翠翠

肺泡灌洗液樣本微生物宏基因組的提取及文庫構建方法，其屬于生物技術領域。提取方法包括了樣本前處理，宿主核酸去除過程以及病原微生物核酸的提取，提供了細胞裂解液BufferDL試劑，采用氧化鋯珠物理機械研磨促進目的核酸的提取；文庫構建包括了抽提產物的DNA片段化、末端修復及A尾添加，接頭連接，產物純化，PCR富集，產物分選，其中DNA片段化、末端修復及A尾添加采用高質量酶組合物，包括核酸內切酶、DNA聚合酶和核酸外切酶，將核酸片段化，末端修復和加A尾一步完成，得到的高質量二代測序文庫可根據不同測序儀要求進行樣本的病原微生物宏基因組檢測。縮短了核酸提取和文庫構建的時間并保證了高通量測序的要求。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種基于肺泡灌洗液樣本病原微生物宏基因組的檢測流程，具體包括DNA的提取及文庫構建方法。

背景技術

眾多研究表明感染性疾病是不明發熱的重要病因，而患者肺部感染居多。在病原診斷的取樣過程中，與咽拭子、痰液等樣本相比，肺泡灌洗液直接取材于病變部位，可避免口腔微生物的干擾，提高致病性病原體的檢出率，對臨床診斷具有更高的特異性。感染性疾病診斷可采用傳統形態學檢測方法，但對于一些厭氧菌或病毒等存在培養困難問題，而免疫學及分子生物學檢測無法對未知感染源做出判定。高通量測序的宏基因組技術可直接對臨床樣本中的核酸進行高通量測序，通過數據庫序列比對判斷所有微生物信息，在臨床檢測中發揮著重要的作用。

因此獲取高純度、高質量的宏基因組DNA是宏基因組學技術順利開展的有力保證，測序文庫質量高低是能否獲得有效數據的關鍵影響因素之一。而現有的核酸提取方法普遍存在操作時間長，核酸降解嚴重，最后獲得的核酸純度不高等問題。氧化鋯珠由微米級及亞納米級氧化鋯與氧化釔為原料制成，具有穩定性好，高強度，高密度、耐高溫、耐腐蝕且成本低等優點，在核酸提取過程中使用氧化鋯珠可在短時間內破碎裂解樣本，研磨過程中產生熱量少，且研磨強度大，可有效避免蛋白質的變性和核酸的降解。DNA片段化是準備NGS測序文庫的第一個主要步驟。高水平的NGS分辨率是通過對每個DNA區域的不同Reads進行多次表示來實現的，而不管它們的序列和上下文。換句話說，片段的序列必須重疊。因此，NGS的質量在很大程度上取決于DNA片段化的隨機性和生成的文庫片段的重疊。這使得碎片化步驟在文庫構建過程中至關重要。

發明內容

為解決現有技術問題，本發明的目的是提供一種基于肺泡灌洗液樣本病原微生物宏基因組的提取方法和文庫構建的方法。針對肺泡灌洗液樣本進行去宿主提取病原微生物核酸，通過DNA片段化、末端修復及A尾添加一體縮短文庫構建時間，以期克服了現有技術操作時間長，文庫構建質量不高等問題。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種基于肺泡灌洗液樣本病原微生物宏基因組的檢測流程，其中肺泡灌洗液樣本核酸提取方法包括如下步驟：

SA1:樣本前處理：拿到新鮮的灌洗液樣本后，離心收集沉淀，當收集沉淀后樣本粘稠時，加入液化試劑液化樣本，液化后清洗掉液化試劑，PBS緩沖液重懸樣本定容至1mL；當收集沉淀后樣本不粘稠時，直接PBS緩沖液重懸樣本定容至1mL；

SA2:去宿主過程：在重懸的樣本管內直接加入細胞裂解液200-500uL，漩渦震蕩5-15min，離心棄凈上清，核酸酶1-10uL，37℃孵育5-15min，再加入10-25uLProteinase K孵育57℃5-15min。