[發(fā)明專利]高精度腺嘌呤堿基編輯器及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210163391.3
• 申請日: 2022-02-22
• 公開（公告）號: CN114606227A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃強;朱海霞;杜文豪;姜欣怡;秦琴
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N15/113;C12N1/21;C12N5/10
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1.一種高精度腺嘌呤堿基編輯器，其特征在于，是將野生型ABE8e的32個氨基酸的linker即177位至208位氨基酸分別替換成ETRS、NKTYPP、TTEPPDN、PAPA、PAPAPAP、A(EAAAK)₂A后重組所得，依次記為4L-ABE8e、4P-ABE8e、6L-ABE8e、7L-ABE8e、7P-ABE8e和12EK-ABE8e；其核苷酸序列分別為SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列分別為SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14所示。

2.一種表達載體，其含有如權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列。

3.一種宿主細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)化如權(quán)利要求2所述的表達載體。

4.如權(quán)利要求1所述的六個高精度腺嘌呤堿基編輯器的制備方法，其特征在于，具體步驟包括：首先，構(gòu)建如權(quán)利要求2所述的多核苷酸序列表達載體；然后，將所述表達載體轉(zhuǎn)化至如權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，篩選并挑出單克隆；最后，將所述單克隆誘導(dǎo)表達，并通過親和層析、分子篩方法從表達產(chǎn)物中分離出所述的六個高精度腺嘌呤堿基編輯器。

5.一種如權(quán)利要求1所述的高精度腺嘌呤堿基編輯器或者如權(quán)利要求2所述的表達載體作為編輯基因組DNA的編輯工具在基因組DNA片段的相關(guān)編輯中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因編輯是編輯位點大于兩個的多位點編輯；所述編輯的手段是腺嘌呤(A)到鳥嘌呤(G)的堿基轉(zhuǎn)換。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特性在于，所述的六個高精度腺嘌呤堿基編輯器即4L-ABE8e、4P-ABE8e、6L-ABE8e、7L-ABE8e、7P-ABE8e和12EK-ABE8e作為編輯工具，包括與靶標(biāo)DNA片段匹配的引導(dǎo)sgRNA；所述的六個高精度腺嘌呤堿基編輯器能夠與介導(dǎo)它的sgRNA組合，對目的基因進行編輯。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特性在于，所述的表達載體和與之匹配的引導(dǎo)sgRNA一同轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，對基因進行編輯。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特性在于，所述多位點的腺嘌呤(A)到鳥嘌呤(G)的堿基轉(zhuǎn)換，是利用腺嘌呤堿基編輯器對腺嘌呤(A)的脫氨作用，并通過宿主細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)對雙鏈之間的錯配進行修復(fù)，從而將堿基從腺嘌呤(A)轉(zhuǎn)換成鳥嘌呤(G)。