[發明專利]一種基于啟動子構建文庫的方法及其文庫

在審

• 申請號: 202210161966.8
• 申請日: 2022-02-22
• 公開（公告）號: CN114411266A
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 王娟;唐沖
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因股份有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 周建軍;彭家恩

1.一種基于啟動子構建文庫的方法，包括：

打斷步驟，包括對待測樣本進行打斷處理，獲得打斷后的待測樣本；

酶促甲基化轉化步驟，包括對打斷后的待測樣本進行酶促甲基化轉化，使非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶；

T7啟動子連接步驟，包括將酶促甲基化轉化處理后的待測樣本與T7啟動子退火，反應得到連接有T7啟動子的待測樣本；

體外轉錄步驟，包括將所述連接有T7啟動子的待測樣本轉錄為RNA；

反轉錄及擴增步驟，包括對所述RNA進行反轉錄、PCR擴增，獲得所述文庫。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述T7啟動子連接步驟中，退火反應條件如下：95～98℃，1～3min；55～65℃，1～3min；25～40℃，1～5min。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述T7啟動子連接步驟中，退火結束后，將退火后的待測樣本與dNTP以及DNA聚合酶混合反應，得到反應后的待測樣本。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，將退火后的待測樣本與dNTP以及DNA聚合酶混合反應時，反應條件如下：30～37℃，15～25min；65～75℃，10～20min。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，T7啟動子連接步驟結束后，不進行純化，直接進行體外轉錄。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，打斷步驟中，使用酶對待測樣本進行打斷；

優選地，所述酶包括Tn5轉座酶；

優選地，所述酶包埋有生物素修飾的接頭；

優選地，打斷步驟中，打斷處理后，加入補平反應液，反應得到補平缺口后的待測樣本；

優選地，打斷步驟中，補平缺口后，使用磁珠對待測樣本進行純化。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，酶促甲基化轉化步驟中，使用加氧酶氧化待測樣本中的DNA，然后使用脫氨酶進行脫氨，反應得到脫氨后的待測樣本；

優選地，所述加氧酶包括TET酶；

優選地，所述TET酶包括TET1酶、TET2酶、TET3酶中的至少一種；

優選地，所述脫氨酶包括APOBEC酶；

優選地，體外轉錄步驟中，使用T7 RNA聚合酶將所述連接有T7啟動子的待測樣本轉錄為RNA；

優選地，打斷步驟中，所述待測樣本包括基因組DNA樣本、游離DNA樣本中的至少一種；

優選地，打斷步驟中，所述待測樣本的核酸分子中含有5-甲基胞嘧啶；

優選地，打斷步驟中，所述待測樣本的起始量≤100pg；

優選地，打斷步驟中，所述待測樣本的起始量為20～100pg。

8.如權利要求1～7任意一項所述方法構建得到的文庫。

9.由權利要求8所述的文庫上機測序所獲得的測序數據。

10.如權利要求9所述的測序數據，其特征在于，所述測序數據的測序深度≤3×；

優選地，所述測序數據的測序深度≤2×。