[發(fā)明專利]一種功能蛋白活性的檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210161596.8
• 申請(qǐng)日: 2022-02-22
• 公開（公告）號(hào): CN114544971A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余惠娟;王笑非
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;C12Q1/02;C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 朱聰聰;劉明星

本發(fā)明公開了一種功能蛋白活性的檢測(cè)方法，屬于蛋白檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明是通過構(gòu)建表達(dá)功能蛋白的細(xì)胞株，再進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)直接檢測(cè)功能蛋白的作用。本發(fā)明設(shè)計(jì)采用3種不同的NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷，通過判斷3種NK細(xì)胞的應(yīng)答情況可以同時(shí)判斷TIGIT和CD16的作用機(jī)制，該方法采用當(dāng)前非常成熟的基因工程技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，容易操作，簡(jiǎn)單快捷。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于蛋白檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種功能蛋白活性的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

NK細(xì)胞是腫瘤免疫監(jiān)視的重要調(diào)節(jié)細(xì)胞，主要存在于外周血、脾臟和骨髓細(xì)胞中，在肝、肺、腸、淋巴結(jié)和子宮中都有發(fā)現(xiàn)，具有天然免疫和適應(yīng)性免疫功能。根據(jù)CD56的表達(dá)情況，人外周血中的NK細(xì)胞可分為CD56^dim和CD56^bright兩種，其中CD56^dim表達(dá)CD16，占外周血中NK細(xì)胞總量的75％以上，具有ADCC活性，是分泌細(xì)胞因子的主要細(xì)胞(Aharon G.Freud,Bethany L.Mundy-Bosse,Jianhua Yu,Michael A.Caligiuri.The broad spectrum ofhuman natural killer cell diversity.Immunity,2017,47,820.)。NK細(xì)胞生物學(xué)功能主要有：1)直接快速識(shí)別變異的靶細(xì)胞，分泌顆粒酶或穿孔素等細(xì)胞因子使靶細(xì)胞裂解；2)通過細(xì)胞表面的CD16蛋白識(shí)別抗體包裹的靶細(xì)胞，產(chǎn)生NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴的ADCC作用，分泌細(xì)胞因子IFN-γ、顆粒酶B等。

TIGIT(T cell immunoglobulin and ITAM domain)，全稱為T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白，是在CD8⁺、CD4⁺T細(xì)胞和NK細(xì)胞高表達(dá)的抑制型受體，它由細(xì)胞外免疫球蛋白可變區(qū)(IgV)結(jié)構(gòu)域，1型跨膜結(jié)構(gòu)域和具有經(jīng)典免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫球蛋白酪氨酸尾(ITT)基序的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，對(duì)NK細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)具有重要作用。TIGIT與配體結(jié)合后，其胞內(nèi)段的ITIM和ITT中的酪氨酸被磷酸化，使NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和細(xì)胞因子的分泌均被抑制。

檢測(cè)功能蛋白活性的方法一般采用相應(yīng)的抗體進(jìn)行阻斷，然后通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)再進(jìn)一步證明，該檢測(cè)方法有賴于阻斷抗體的有效性，且只能間接說明功能蛋白的作用。

發(fā)明內(nèi)容：

為此，本專利構(gòu)建表達(dá)功能蛋白的細(xì)胞株，通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)可直接檢測(cè)功能蛋白的作用。

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種功能蛋白活性的檢測(cè)方法，先構(gòu)建表達(dá)功能蛋白的細(xì)胞株，再通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)功能蛋白的作用。

優(yōu)選地，所述的構(gòu)建表達(dá)功能蛋白的細(xì)胞株是將編碼功能蛋白的核苷酸分子轉(zhuǎn)染至受體細(xì)胞獲得；所述的轉(zhuǎn)染包括但不限于電轉(zhuǎn)染。

優(yōu)選地，所述的受體細(xì)胞為NK-92MI細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述的表達(dá)功能蛋白的細(xì)胞株為表達(dá)TIGIT和/或CD16的細(xì)胞株，具體地，是表達(dá)TIGIT的細(xì)胞株、表達(dá)CD16的細(xì)胞株或同時(shí)表達(dá)TIGIT與CD16的細(xì)胞株。

本發(fā)明第二個(gè)目的提供了CD16在NK細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-γ分泌中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了NK細(xì)胞CD16介導(dǎo)的ADCC是通過分泌IFN-γ發(fā)揮細(xì)胞毒作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明設(shè)計(jì)采用3種不同的NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷，通過判斷3種NK細(xì)胞的應(yīng)答情況可以同時(shí)判斷TIGIT和CD16的作用機(jī)制，能夠直接檢測(cè)功能蛋白的作用。該方法采用當(dāng)前非常成熟的基因工程技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，容易操作，簡(jiǎn)單快捷。

附圖說明