[發明專利]一種檢測接穗評價砧木優劣的芯片及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202210159263.1
• 申請日: 2022-02-21
• 公開（公告）號: CN114752696B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 李天忠;張川;王圣元;王勝男;姜峰;孫世岳
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6837;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京衛平智業專利代理事務所(普通合伙) 11392
• 代理人: 閆萍

1.一種檢測接穗評價砧木優劣的芯片，其特征在于：芯片包括固相載體，固相載體上負載有體外反應試劑；

所述體外反應試劑包括混合緩沖液、核糖核酸酶抑制劑、分子指紋探測器、焦碳酸二乙酯處理水、顏色指示試劑；

所述顏色指示試劑為氯酚紅-β-D-半乳吡喃糖；

所述分子指紋探測器為RNA序列，其核苷酸序列為序列表中編號為3-4，39-42所示序列。

2.一種制備如權利要求1所述芯片的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、向質粒中加入正向引物和反向引物，PCR預混液和水進行PCR擴增；

步驟二、將步驟一得到的PCR擴增產物進行凝膠電泳，得到DNA回收產物，即分子指紋探測器；

步驟三、應用步驟二得到的分子指紋探測器，配制體外蛋白反應試劑；

步驟四、將步驟三得到的體外蛋白反應試劑加入至固相載體中得到芯片；

步驟三中所述的體外蛋白反應試劑配制過程為：將混合緩沖液、RRI、分子指紋探測器、焦碳酸二乙酯、氯酚紅-β-D-半乳吡喃糖混合；以上體系在37℃下恒溫培育2h。

3.如權利要求2所述的一種芯片制備方法，其特征在于：步驟一中所述正向引物和反向引物的核苷酸序列為序列表中編號為11-14，31-38所示序列。

4.一種如權利要求1所述芯片的應用，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、采集砧木接穗韌皮部RNA；

步驟二、以上述RNA為模板，擴增出誘導RNA，具體為：

將韌皮部RNA、焦碳酸二乙酯、RRI加入誘導RNA擴增體系中進行反應得到誘導RNA；上述誘導RNA擴增體系包括五組分緩沖液、NTP混合液、dNTP混合液、酶混合物、引物混合物；

步驟三、將步驟二得到的誘導RNA加入芯片中進行體外蛋白反應；

步驟四、觀察反應變色現象，評價待測接穗對應性狀，進而評價砧木優劣；

步驟三所述進行體外蛋白反應的步驟為：將步驟二得到的1μL誘導RNA加入到芯片中，與芯片中的體外蛋白反應試劑進行反應。

5.如權利要求4所述芯片的應用，其特征在于：

步驟二中所述五組分緩沖液的組分為：

三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂、二硫蘇糖醇和水；

步驟二中所述酶混合物的組分為：

M-MLV逆轉錄酶、T7 RNA聚合酶、AMV逆轉錄酶、核糖核酸酶、牛血清蛋白；

步驟二中所述引物混合物的組分為：

引物(R)、引物(F)、二甲基亞砜、去離子水。

6.如權利要求5所述芯片的應用，其特征在于：步驟四中所述的變色現象的評價過程為：

使用攝像設備在相同拍攝條件下拍攝顏色指示試劑環境顏色的第一顏色向第二顏色變化的過程，并記錄第一顏色向第二顏色轉變所需時間，即反應時間；

使用軟件讀取第一顏色向第二顏色改變過程中RGB值的變化，并根據以下公式計算顏色變化率CCT：

C＝(R+B)/(R+G)；

ΔC＝d[dC/dt]/dt＝d²(R+B)/(R+G)/dt²；

CCT＝ΔC×10⁵；

式中，C：顏色指示試劑環境顏色，R：RGB紅色數值，G：RGB綠色數值，B：RGB藍色數值，ΔC：曲線斜率變化，t：反應時間，CCT：顏色變化率。