[發(fā)明專利]非洲豬瘟病毒的雙通道數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒及方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210156886.3
• 申請(qǐng)日: 2022-02-21
• 公開（公告）號(hào): CN114395643A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 亓文寶;簡(jiǎn)偉俊;朱君海;陳畫菡;張桂紅;廖明;黃一凡;高琦;高飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及非洲豬瘟病毒的雙通道數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒及方法。本發(fā)明提供了非洲豬瘟病毒的雙通道微滴數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒及方法，可以檢測(cè)到多種不同類型的毒株，并鑒別其是否為EP402R缺失株。此外，本發(fā)明提供的產(chǎn)品具有良好的特異性和靈敏度：在幾種常見豬病病毒中僅擴(kuò)增非洲豬瘟病毒、對(duì)pMD18T?EP402R和pMD18T?B646L質(zhì)粒的最低檢測(cè)限分別低至0.43copies/μL和2.6copies/μL。因此本發(fā)明有潛力準(zhǔn)確檢測(cè)非洲豬瘟病毒的隱性感染，可以應(yīng)用于臨床和生產(chǎn)中該豬瘟病毒特別是EP402R基因缺失株快速檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及非洲豬瘟病毒的雙通道數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒及方法。

背景技術(shù)

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是一種病毒性出血病，其病原為非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)，在家豬和歐亞野豬中具有極高的致死率。盡管其宿主范圍有限，且不能感染人，但該病造成的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)影響巨大，自2018年傳入中國(guó)以來，已對(duì)中國(guó)生豬養(yǎng)殖行業(yè)造成毀滅性的打擊。該病容易通過感染豬的污染物、胎兒、糞便、病料組織，以及污染的飼料和飲水等以直接接觸的方式傳播，容易形成大范圍的傳播鏈，除此之外，節(jié)肢動(dòng)物(軟蜱)、鼠、蚊蠅等也能攜帶非洲豬瘟病毒并造成傳播。

早期在中國(guó)流行的非洲豬瘟病毒一般為野生毒株，其無明顯的基因缺失現(xiàn)象，但是隨著病毒在動(dòng)物體內(nèi)不斷繁殖與擴(kuò)散、病毒在各個(gè)疫區(qū)之間的不斷傳播，特別是疑似非法疫苗的擅自使用，目前已經(jīng)出現(xiàn)了部分基因缺失的毒株。這些毒株大多缺失與病毒部分毒力相關(guān)的基因片段，如EP402R基因(CD2v蛋白基因)、MGF-505-3R基因等，其中，以缺失EP402R基因居多。這些基因缺失毒株在豬體內(nèi)的毒力變?nèi)酰《镜味茸兊停R床上常呈隱性感染。上述的野生型毒株和基因缺失毒株長(zhǎng)期存在并不斷在排毒，造成新的非洲豬瘟疫情，不利于非洲豬瘟病毒精準(zhǔn)防控和凈化。因此，檢測(cè)鑒別非洲豬瘟病毒的野生毒株和基因缺失毒株的意義重大。

目前，臨床和生產(chǎn)中廣泛使用的是熒光定量PCR檢測(cè)方法，隨著非洲豬瘟病毒隱性感染的出現(xiàn)和傳播，熒光定量PCR檢測(cè)非洲豬瘟病毒的靈敏度受到挑戰(zhàn)。曾有專利公開了一種非洲豬瘟病毒微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法及應(yīng)用，該發(fā)明自主設(shè)計(jì)并合成引物、探針與重組質(zhì)粒，采用微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)獲得定性或定量的檢測(cè)結(jié)果。該發(fā)明相較于熒光定量PCR等現(xiàn)有技術(shù)具有較好的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性，能有效避免假陰性和假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，但該方法基于兩段保守序列VP72和K205R，無法鑒別檢測(cè)野毒株與基因缺失毒株。

因此，有必要研發(fā)能快速檢測(cè)鑒別非洲豬瘟病毒基因缺失株尤其是EP402R基因缺失株的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供檢測(cè)非洲豬瘟病毒的野生株、EP402R基因缺失株的雙通道數(shù)字PCR的產(chǎn)品和方法。

本發(fā)明提供了非洲豬瘟病毒EP402R基因的檢測(cè)引物和探針，包括：

EP402R基因上游引物，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

EP402R基因下游引物，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示；

EP402R基因探針，其核酸序列如SEQ ID NO:3所示。

所述的EP402R基因探針，其5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)HEX，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。

本發(fā)明提供的EP402R基因的引物與現(xiàn)有技術(shù)相比具有更高的保守性，能適用于更多類型的毒株。

所述EP402R引物和探針能夠特異性地和EP402R基因結(jié)合。

本發(fā)明還提供了非洲豬瘟病毒B646L基因的檢測(cè)引物和探針，包括：

B646L基因上游引物，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示；