[發(fā)明專利]一種玉米miRNA的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210144952.5
• 申請日: 2022-02-17
• 公開（公告）號: CN114395557B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐玉芳;張會勇;李濤;汪仁潔
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/66;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 西安匯恩知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61244
• 代理人: 張偉花

1.一種玉米miRNA的應(yīng)用，其特征在于，所述玉米miRNA命名為zma-unmiR4，所述zma-unmiR4響應(yīng)擬輪枝鐮孢菌Fusarium?verticillioides的侵染，用于負(fù)調(diào)控植株對擬輪枝鐮孢菌Fusarium?verticillioides的抵抗能力，所述zma-unmiR4的成熟轉(zhuǎn)錄本核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米miRNA的應(yīng)用，其特征在于，所述zma-unmiR4通過在擬南芥中異源表達(dá)，負(fù)調(diào)節(jié)擬南芥對擬輪枝鐮孢菌的抵抗能力。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種玉米miRNA的應(yīng)用，其特征在于，所述zma-unmiR4通過在擬南芥中異源表達(dá)的方法為：

S1、用XhoI/SacI雙酶切pJim19載體，在溫度為37℃的條件下酶切反應(yīng)6?h，將酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠分離，切下11Kb大小的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，得到XhoI/SacI雙酶切pJim19載體的回收產(chǎn)物；

所述酶切反應(yīng)的體系為：XhoI酶1μL，SacI酶?1μL，Cutsmart?buffer?5?μL,?pJim19載體10?μL,?滅菌超純水補(bǔ)至50?μL；

S2、以玉米自交系B73的cDNA文庫為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆zma-unmiR4的初級轉(zhuǎn)錄本，將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠分離，切下498bp大小的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，得到PCR回收產(chǎn)物，即為zma-unmiR4的初級轉(zhuǎn)錄本；

所述PCR擴(kuò)增的體系為：2×KOD?Mix?10μL，特異性引物F?1μL、特異性引物R?1μL、玉米自交系B73的cDNA文庫1μL，滅菌超純水補(bǔ)至20μL；所述特異性引物F的核苷酸序列如SEQ?IDNO:3所示，所述特異性引物R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示；

所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性10min；98℃變性10s，55℃退火10s，68℃延伸40s，擴(kuò)增40個循環(huán)；68℃延伸10min；

?S3、利用同源重組方法將zma-unmiR4的初級轉(zhuǎn)錄本連接至pJim19載體的XhoI/SacI之間，在溫度為50℃的條件下連接反應(yīng)25min，得到連接產(chǎn)物，將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，擴(kuò)增繁殖，利用質(zhì)粒提取試劑盒，得到pJim19-zma-unmiR4載體質(zhì)粒；

所述zma-unmiR4的初級轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；

所述pJim19-zma-unmiR4載體質(zhì)粒能表達(dá)所述zma-unmiR4的成熟轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列；

所述連接反應(yīng)的體系為：2×Hieff?Clone?Enzyme?Premix?5μL，S1中得到的XhoI/SacI雙酶切pJim19載體的回收產(chǎn)物2μL，S2中得到的PCR回收產(chǎn)物1μL，滅菌超純水補(bǔ)至10μL；

S4、轉(zhuǎn)基因植株的種子獲得：

將步驟1中得到的pJim19-zma-unmiR4載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101后，得到重組農(nóng)桿菌，侵染擬南芥花絮20s，將侵染后的擬南芥花絮所結(jié)的種子收獲，得到轉(zhuǎn)基因植株的種子；

S5、陽性轉(zhuǎn)基因植株的鑒定：將S4中得到的轉(zhuǎn)基因植株的種子播在含有30μg/mL的MS固體板上，能夠正常生長的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株；

S6、鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株中zma-unmiR4初級轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量：

S601、第一鏈cDNA的合成：提取S5中得到的陽性轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，測量所述總RNA的濃度，取1μg的所述總RNA用1μL的DNase?I在37℃的條件下消化處理30min，然后在70℃的條件下加熱10min，之后放置冰上，依照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒的用量加入反轉(zhuǎn)錄所需試劑，42℃孵育1h，95℃變性5min后，將反應(yīng)體系置于冰上，加入四倍體積的滅菌超純水，得到第一鏈cDNA；

S602、RT-PCR檢測分析：

以S601中得到的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；

所述RT-PCR擴(kuò)增的體系為：S601中得到的第一鏈cDNA?1μL、2×Tag?Mix?10μL、zma-unmiR4?q-F引物1μL、zma-unmiR4?q-R引物1μL、滅菌超純水補(bǔ)至20μL；

所述zma-unmiR4?q-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:5所示，所述引物zma-unmiR4?q-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:6所示；

所述RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30?s，55℃退火30s，72℃延伸30?s，擴(kuò)增30個循環(huán)；72℃延伸5?min；

并以哥倫比亞野生型擬南芥作為對照，所述哥倫比亞野生型擬南芥所使用的引物為Actin?q-F和Actin?q-R；

所述Actin?q-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:7所示，所述引物Actin?q-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:8所示；

利用RT-PCR的方法檢測S5中得到的陽性轉(zhuǎn)基因植株中zma-unmiR4初級轉(zhuǎn)錄本的相對積累量，利用S602中所述zma-unmiR4?q-F引物和zma-unmiR4?q-R引物，能夠擴(kuò)增出286bp的條帶，并且利用ImageJ軟件分析條帶亮度，條帶越亮，所述陽性轉(zhuǎn)基因植株中zma-unmiR4初級轉(zhuǎn)錄本的相對積累量越高。