[發明專利]一種具有抑菌功能的脫細胞小腸粘膜下層復合骨支架的制備方法

在審

• 申請號: 202210142830.2
• 申請日: 2022-02-16
• 公開（公告）號: CN114288473A
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 卞鐵榮;邢宏運;邢一博;龍笑;梁彬
• 申請（專利權）人: 西南醫科大學附屬醫院
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/50;A61L27/54;A61L27/56
• 代理公司: 湖北創融藍圖知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42276
• 代理人: 陳沖

本發明提供具有抑菌功能的脫細胞小腸粘膜下層復合骨支架的制備方法。所述制備方法包括步驟：(1)取新鮮空腸，切割成若干個長約10?18cm的腸段反復擦拭去除小腸的黏膜層、肌層和漿膜層。(2)處理后浸泡在0.25％胰蛋白酶溶液中37℃消化24h，蒸餾水漂洗。(3)隨后浸入0.5％SDS中37℃持續震蕩脫細胞24h，蒸餾水漂洗。(4)隨后放置在過氧乙酸的乙醇溶液中浸泡8h，蒸餾水漂洗后低溫冷凍干燥，環氧乙烷消毒制得生物基質膜SIS；(5)生物基質膜SIS置于蜂蜜溶液中過夜，隨后冷凍干燥，得到脫細胞小腸粘膜下層納米纖維復合骨支架。本發明的骨支架通過浸漬蜂蜜，不僅獲得了抑菌性能，而且該支架具有三維網絡結構，具有生物礦化與降解活性及細胞相容性。

技術領域

本發明涉及醫用材料技術領域，具體涉及一種具有抑菌功能的脫細胞小腸粘膜下層復合骨支架的制備方法。

背景技術

隨著組織工程骨的不斷深入研究，制備細胞外基質模擬與自體骨類似的微環境逐漸受到組織工程研究人員的關注。小腸粘膜下層SIS為完全去細胞化的基質膜，主要成分為膠原，它具有大多數膠原產品的共同特性，即較強的韌性。且該膠原仿生了骨膠原的形狀與分子結構，主要由有序排列的Ⅰ型膠原纖維組成，這種三維納米網絡結構類似骨3D細胞外基質蛋白。其上分布有粘多糖、蛋白聚糖、糖蛋白、肝素、纖連蛋白和各種功能的增長因子，包括基本成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、轉變增長因子factor-β(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子-1和神經生長因子等，植入人體的SIS幾乎沒有免疫排斥性。因此，SIS用作組織工程替代材料不僅能起到支撐作用，同時其蘊含的多種生物信息也能調控細胞的各種生命活動和體內組織的修復再生。

SIS作為合成羥基磷灰石(HA)的生物模板，在模擬體液中能夠迅速誘導羥基磷灰石的合成。合成的羥基磷灰石具有天然的骨傳導性與骨整合能力，骨傳導性為血管的長入和新骨的形成提供支架，骨整合特性實現支架與骨組織支架的無纖維結締組織界面層的直接接觸，支架植入后不會發生松動失效。這些特征表明其為骨組織工程中應用前景廣闊的生物材料。國內外使用SIS材料作為骨組織工程骨架材料已有一些報道，但一個關鍵問題使SIS應用受到限制。SIS天然抗菌能力有限，植入體內后，常會伴生感染，引起炎癥，如果不能采取有效的抗菌手段，會導致植入失敗。

在全球范圍內，骨折愈合期間易受到細菌的感染，引發炎癥，給患者和醫療系統帶來了顯著的負擔。此外，細菌誘導的感染阻礙了再上皮化和膠原合成，從而挑戰骨愈合過程。到2021年，全球抗感染市場估計將達到204億美元。然而由于抗生素的亂用和濫用，許多細菌產生了耐藥菌株，并且其出現頻率已超過了抗生素新藥的開發速度。由此給疾病的治療帶來了很大的困難。盡管抗菌肽是宿主非特異性免疫防御系統產生的一類對抗外源性病原體的肽類活性物質，是天然免疫的效應分子，不易誘導耐藥菌株的產生，抗菌譜廣。對高等動物細胞無害，體內無殘留，但其抗菌活性遠不及傳統抗生素。納米粒子具有適當的抗菌性能，它們也可以作為一個擴散到體內導致小尺寸和嚴重的健康問題的病人。

發明內容

本發明所要解決的問題是一種綠色合成、操作工藝簡單、具有三維網絡結構、生物活性與抑菌功能的脫細胞小腸粘膜下層SIS/HONEY復合骨支架的制備方法，旨在通過天然蜂蜜與脫細胞小腸粘膜下層SIS復合的方式，制備出具有抑菌功能的納米纖維網絡結構、可降解、礦化的脫細胞小腸粘膜下層SIS/HONEY復合骨支架。

本發明首先提供一種具有抑菌功能的脫細胞小腸粘膜下層復合骨支架的制備方法：

(1)取屠宰4h內的經過檢疫的健康成年家畜的新鮮空腸，用清水反復沖洗干凈后，選取管腔粗細相對均勻，管壁無明顯破損，無淋巴結附著的部位將其切割成若干個長約10-18cm的腸段，縱向剖開鋪平，反復擦拭去除小腸的黏膜層。翻轉小腸，用同樣的方法去除肌層和漿膜層，用蒸餾水反復漂洗去除小腸粘膜下層上殘留的組織；

(2)將機械方法制得的小腸粘膜下層浸泡在0.25％胰蛋白酶溶液中37℃消化24h，蒸餾水反復漂洗。