[發明專利]一種靶向脂滴的免洗熒光成像納米探針制備及使用方法

有效

• 申請號: 202210141414.0
• 申請日: 2022-02-16
• 公開（公告）號: CN114470244B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 徐抒平;霍澤鵬;徐蔚青
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00
• 代理公司: 長春市恒譽專利代理事務所(普通合伙) 22212
• 代理人: 李榮武

本方案屬于熒光納米材料制造領域，涉及一種靶向脂滴的免洗熒光成像納米探針制備及使用方法。該探針對溶劑極性敏感，具有單、雙光子熒光特性?？擅庀磳崿F細胞內脂滴的快速成像。具體是將N,N?二乙基對苯二胺與無水乙醇所形成的溶液在反應釜200℃條件下進行12h的溶劑熱反應，以二氯甲烷和甲醇作為洗脫劑，后經旋轉蒸發得到碳點類熒光探針。該探針量子產率高、穩定性好、生物相容性優異；在疏水性的油性介質里表現出極高的熒光強度，而在水環境中熒光得以淬滅，可實現脂滴的特異性成像。本發明所制備的納米探針具有免洗特性，簡化了細胞處理步驟，可實現成像信號與背景的高反差?？捎米魃飳拡龀上瘛⒐簿劢钩上?、超分辨熒光成像等。

技術領域

本方案屬于熒光納米材料制造領域，涉及一種活細胞內脂滴特異性靶向的納米探針的制備方法和使用方法，尤其涉及一種兼具上下轉換熒光性質，可以匹配共聚焦成像和雙光子熒光成像系統的環境敏感的、免洗的碳點探針。

背景技術

脂滴(LDs)是由中性脂質核心組成的脂質儲存細胞器，主要包含膽固醇酯和甘油三酯，由磷脂單層外殼覆蓋。脂滴主要存在于真核生物的脂肪組織中，也存在于其他類型的細胞中，因為脂滴參與了不同的細胞過程，如膜形成、運輸和蛋白質-蛋白質相互作用等，故在調節細胞脂質代謝中起著非常重要的作用而受到了廣泛關注。此外，脂滴功能的失調會導致代謝紊亂，如肥胖、脂肪肝、糖尿病、動脈粥樣硬化等。為了探究脂滴在不同代謝紊亂中的作用，了解脂滴與其他細胞器之間的相互作用，發展可靠、實時、高保真的脂滴成像方法和探針是非常重要的。細胞脂滴的可視化可以通過多種成像和譜學方法來實現，例如傳統的透射光顯微鏡、拉曼顯微鏡和質譜法等。這些先進的技術使人們能夠研究細胞脂滴的相關信息，但它們需要復雜的樣品制備和數據分析。此外，上述方法通常需要固定細胞或提取脂滴，忽略了研究細胞自身環境中脂滴的實時動態變化的特性。另一方面，熒光成像技術由于其高靈敏度，已被證明是研究復雜生物過程的有力方法，廣泛應用于細胞相關生理過程的研究。

然而，目前用于脂滴的熒光探針(包括尼羅紅和BODIPY 493/503)具有局限性。首先，尼羅紅非特異性的細胞器靶向性，導致對脂滴具有較低的選擇性。此外，尼羅紅因其在細胞中的寬發射光譜而不適合多色成像。而BODIPY 493/503也由于其短斯托克斯位移和低的光穩定性不利于脂滴的成像研究。

雙光子熒光是分子本身吸收兩個光子后到達激發態能級，落回至基態過程中而發射出熒光的一種上轉換發光現象。因其具有較長的激發波長，因而將生物體本身熒光和光損傷降低到最小。基于這種原理開發出的雙光子顯微鏡(TPM)可以在成像生物樣品的同時獲得內在深層組織區域高分辨率圖像。此外，具有雙光子熒光特性并具備脂滴靶向性的探針為研究脂滴與其他細胞器互作、脂滴生成機制及其在細胞內動態變化提供了可能。因此，開發多色、低毒性、高靶向性、具有雙光子特性的脂滴選擇性熒光探針。是監測脂滴相關的生理過程的迫切需求。

碳點(CDs)，通常是指尺寸介于納米尺度、具有熒光性質的含碳納米顆粒。熒光碳點的結構一般是sp²、sp³碳的雜化結構,一般具有明顯的晶格結構。由于具有合成工藝簡單、光學性能優異、發光可調、生物相容性好等諸多優點，近來引發了人們的廣泛關注。得益于其顯著的優勢，碳點被廣泛應用于生物傳感、細胞成像、光電催化等領域。然而，目前對于其光學性能的調控，尤其是開發具有雙光子特性的碳點報道較少，具有一定挑戰性。碳點另的一個優點是其良好的細胞內滯留能力，目前已經開發出多種細胞器靶向的碳點，如溶酶體、線粒體、細胞核等，允許對靶標物質進行連續和長期的跟蹤。這種新型的熒光探針為長時間研究脂滴、脂滴與其他細胞器互作、脂滴生成機制及其在細胞內動態變化提供了可能。然而，目前針對脂滴特異性靶向的碳點報道較少。

發明內容

本發明涉及一種細胞內脂滴特異性靶向的納米探針的制備方法和用途。同時，該探針具有雙光子熒光特性，可以在780nm皮秒激光激發下、免洗的實現活細胞內脂滴的高質量成像；且具有量子產率高、穩定性好、生物相容性優異、操作簡單的優點。其優勢是可以免洗，與背景信號相比，具有更高的成像反差。