[發明專利]一種3-甾酮-Δ1

有效

• 申請號: 202210138785.3
• 申請日: 2022-02-15
• 公開（公告）號: CN114621965B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發明（設計）人: 陳芬兒;張婭嬌;韋建海
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/70;C12N1/21;C12P33/02;C12R1/19
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1.一種3-甾酮-Δ¹-脫氫酶突變體基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一種3-甾酮-Δ¹-脫氫酶突變體，其特征在于，為如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的突變體，所述突變體的突變方式為指定位置的氨基酸殘基突變，所述指定位置選自如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的第60位，第141位，第122位，以及第428位的氨基酸。

3.根據權利要求2所述的3-甾酮-Δ¹-脫氫酶突變體，其特征在于，所述述指定位置的氨基酸殘基突變包括以下任意一種或幾種突變方式：突變體格式XnY/Z，表示第n位氨基酸殘基X替換為氨基酸殘基Y或者氨基酸殘基Z；具體包括：H141M，V428W，L122F及M60L。

4.根據權利要求3所述的3-甾酮-Δ¹-脫氫酶突變體，其特征在于，所述突變體指定位置的氨基酸殘基突變包括所述指定一個或多個位置氨基酸殘基替換，表示為MKX，其中X表示共有幾個突變位點，具體包括以下任意一種替換方式：

單點突變體MK1；H141M；

兩點突變體MK2：V428W，H141M；

三點突變體MK3：L122F，V428W，H141M；

四點突變體MK4：M60L，L122F，V428W，H141M。

5.一種重組表達質粒，其特征在于，能表達權利要求2、3或4所述的3-甾酮-Δ¹-脫氫酶突變體，是將3-甾酮-Δ¹-脫氫酶突變體基因連接至質粒pET28a上構建得到；構建的重組表達質粒包括pET28a-MK1或 pET28a-MK2或 pET28a-MK3或 pET28a-MK4；3-甾酮-Δ¹-脫氫酶四點突變體基因序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.一種重組表達菌體，其特征在于，所述重組表達菌體包含權利要求5所述的重組表達質粒。

7.根據權利要求6所述的重組表達菌體，其特征在于，將pET28a-MK1或 pET28a-MK2或pET28a-MK3或 pET28a-MK4任意一種重組表達質粒轉化進大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，構建得3-甾酮-Δ¹-脫氫酶突變體重組菌株。

8.如權利要求2、3或4所述的3-甾酮-Δ¹-脫氫酶突變體在制備甾體藥物及甾體藥物中間體中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，將3-甾酮-Δ¹-脫氫酶突變體催化3-甾酮化合物的C1，C2位脫氫反應，合成潑尼松龍。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：將3-甾酮-Δ¹-脫氫酶重組表達質粒在大腸桿菌中表達，在100 mL，50 mM，pH8.0 的Tris緩沖液中加入5g表達菌體，添加PMS30 mM，加入10 mL二甲亞砜溶解的濃度為100 mM的3-甾酮化合物，在25℃下，200 rpm反應0.5-2 h；反應完成后，添加兩倍體積乙酸乙酯進行萃取，萃取液加入無水硫酸鎂粉末除去有機相中的水，旋轉蒸發除去乙酸乙酯，干燥，獲得目標產物粉末。