[發明專利]構建產L-纈氨酸的重組微生物的方法及其所用核酸分子和生物材料

在審

• 申請號: 202210137750.8
• 申請日: 2022-02-15
• 公開（公告）號: CN114540262A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 孟剛;魏愛英;齊曉琴;賈慧萍;趙春光;蔡衛衛
• 申請（專利權）人: 寧夏伊品生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/77;C07K14/34;C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了構建產L?纈氨酸的重組微生物的方法及其所用核酸分子和生物材料。具體地公開了突變蛋白質CEY17_RS14810^G397Y及其編碼基因。本發明構建了包含突變(GG?TA)的基因工程菌，以及過表達CEY17_RS14810基因或其突變基因的工程菌。實驗表明，CEY17_RS14810基因及其變體參與了L?纈氨酸的生物合成，對CEY17_RS14810基因編碼區進行突變或在生產菌中過表達CEY17_RS14810基因和/或其突變體，有助于L?纈氨酸產量及轉化率的提高，可以培育符合工業化生產的高產高質量菌種，對L?纈氨酸的工業化生產具有重要的意義。

技術領域

本發明屬于微生物變異或遺傳工程技術領域，具體涉及構建產L-纈氨酸的重組微生物的方法及其所用核酸分子和生物材料。

背景技術

L-纈氨酸(L-valine)，化學名稱為α-氨基異戊酸，是支鏈氨基酸之一，人和動物自身不能合成。L-纈氨酸是人體八種必需氨基酸之一，具有促進蛋白合成、抑制蛋白分解的作用，增強機體的免疫防護作用，有助于糾正因手術、創傷、感染等引起的負氮平衡。另外，L-纈氨酸還具有抗中樞疲勞的作用，抗外周疲勞作用，延緩運動性疲勞，加快運動后機體的修復，因此在食品和醫藥行業具有廣泛的應用及商業價值。由L-纈氨酸配制的復合支鏈氨基酸輸液在血腦屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及腎功能衰竭的治療，先天性代謝缺陷病的膳食治療，敗血癥及術后糖尿病患者的治療，加快外科創傷愈合的治療和腫瘤患者的營養支持治療中應用廣泛。L-纈氨酸在食品工業上主要用作食品添加劑、營養增補液及風味劑等。L-纈氨酸凝膠具有帶正電的端基，是新型低分子量凝膠，可以制備形成水凝膠，其在生物醫藥、組織工程、光化學、電化學、食品工業、化妝品等領域已被廣泛應用。

目前，L-纈氨酸的生產方法主要有提取法、化學合成法、發酵法。提取法和化學合成法由于原料來源受限制、生產成本高、收率低，污染嚴重，難以實現工業化生產。微生物直接發酵法生產L-纈氨酸具有原料來源廣泛，成本低、反應條件溫和、容易實現大規模生產等優點，是一種非常經濟、高效的生產方法。而工業發酵中獲得高產的菌種，對于L-纈氨酸的發酵生產來說是至關重要的，是整個L-纈氨酸發酵工業的核心，是決定發酵產品工業價值的重要因素。隨著基因工程育種技術的不斷發展，從分子水平上改造生產菌，研究和挖掘相關基因的功能，為L-纈氨酸的工業化發酵生產提供了廣闊的前景。選育高產、穩定的生產菌種，促進L-纈氨酸在微生物體內的積累，進一步提高L-纈氨酸的產量將一直伴隨L-纈氨酸發酵工業的發展，對于促進L-纈氨酸產業化的進程具有重要的意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何提高微生物L-纈氨酸的產量，所要解決的技術問題不限于所描述的技術主題，本領域技術人員通過以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術主題。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了一種構建重組微生物的方法，所述方法包括至少下述任一種：

F1)將編碼蛋白質的核酸分子導入目的微生物，得到所述重組微生物，所述蛋白質名稱為CEY17_RS14810^G397Y，可為下述任一種：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白質，

A2)將SEQ ID No.4所示的氨基酸序列經過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與A1)所示的蛋白質具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質，

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端連接標簽得到的具有相同功能的融合蛋白質；

F2)將SEQ ID No.1所示的DNA分子導入目的微生物，得到所述重組微生物；

F3)利用基因編輯手段(如單堿基基因編輯)對SEQ ID No.1所示的DNA分子進行編輯，使目的微生物中含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。