[發明專利]一種高效的增殖分化細胞的細胞分裂蛋白的檢測方法

在審

• 申請號: 202210132180.3
• 申請日: 2022-02-14
• 公開（公告）號: CN115521971A
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 朱灝
• 申請（專利權）人: 華夏源細胞工程集團股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12Q1/6806;C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種高效的增殖分化細胞的細胞分裂蛋白的檢測方法，步驟包含以下幾步：S1：配置細胞裂解液，將增殖分化細胞進行細胞裂解；S2：配置反轉錄混合液，形成酶制反轉錄反應體系，采用PCR儀進行反轉錄反應；S3：配置QPCR反應混合液，形成QPCR反應體系，采用QPCR儀進行熒光定量反應；S4：結果判斷。本發明申請中通過細胞裂解液中復配加入苯甲基磺酰氟和β?硫基乙醇，并限定細胞裂解液，反轉錄反應體系和QPCR反應體系中的各成分的體積比有效提高了細胞裂解和反應效率，充分縮短了增殖分化細胞細胞分裂蛋白活性檢測所需要的時間，且準確度更高。

技術領域

本發明涉及IPC分類中的A61醫學領域，尤其涉及一種高效的增殖分化細胞的細胞分裂蛋白的檢測方法。

背景技術

間充質干細胞是目前備受關注的一類具有高度自我更新和多向分化潛能的增殖分化細胞，即多功能干細胞；常見的增殖分化細胞細胞分裂蛋白(端粒酶)活性檢測的方法主要包括TRAP法，TRAP-ELISA法及TRAP銀染法等；但是例如現有技術(CN201710893473.2)中使用的TRAP法對端粒酶活性的檢測方法，存在以下問題，例如檢測樣本范圍有限(不適用于新鮮的或反復凍存后復蘇的增殖分化細胞的檢測)，檢測時間相對較長以及檢測成本相對較高，檢測樣本數目受限或低通量下的檢測，實驗結果難以定量分析等。

因此，亟需一種能夠具有高檢測效率，使得檢測時間有效縮短的增殖分化細胞細胞分裂蛋白活性的檢測方法。

發明內容

為了解決上述問題，本發明第一方面提供了一種高效的增殖分化細胞的細胞分裂蛋白的檢測方法，步驟包含以下幾步：S1：配置細胞裂解液，將增殖分化細胞進行細胞裂解；S2：配置反轉錄混合液，形成酶制反轉錄反應體系，采用PCR儀進行反轉錄反應；S3：配置QPCR反應混合液，形成QPCR反應體系，采用QPCR儀進行熒光定量反應；S4：結果判斷。

PCR儀：PCR儀又稱為PCR基因擴增儀、PCR核酸擴增儀、聚合酶鏈反應核酸擴增儀，是利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)技術對特定DNA擴增的一種儀器設備，被廣泛運用于醫學、生物學實驗室中，例如用于判斷檢體中是否會表現某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、基因復制以及親子鑒定等。

QPCR儀：實時熒光定量PCR儀，由熒光定量系統和計算機組成，用來監測循環過程的熒光，與實時設備相連的計算機收集熒光數據。主要通過在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法儀器。

作為一種優選的方案，所述細胞裂解液與增殖分化細胞的用量比為16～24μL/10⁶個。

作為一種優選的方案，所述細胞裂解液包括細胞裂解緩沖液，苯甲基磺酰氟溶液和β-硫基乙醇溶液。

作為一種優選的方案，所述苯甲基磺酰氟溶液為將0.1M苯甲基磺酰氟溶液用細胞裂解緩沖液稀釋4～6倍的苯甲基磺酰氟溶液；所述β-硫基乙醇溶液為將β-硫基乙醇用細胞裂解緩沖液稀釋18～22倍的β-硫基乙醇溶液。

作為一種優選的方案，所述細胞裂解緩沖液，苯甲基磺酰氟溶液和β-硫基乙醇溶液的體積比為900～1100：3～7：4～8。

作為一種優選的方案，所述反轉錄混合液包括細胞分裂蛋白反應緩沖液，無核酸酶水和待測樣本。

作為一種優選的方案，所述細胞分裂蛋白反應緩沖液，無核酸酶水和待測樣本的體積比為3～5：14.5～16.5：0.5。

作為一種優選的方案，所述QPCR反應混合液包括細胞分裂蛋白引物儲備液，核酸染色液，無核酸酶水和反轉錄樣本。

作為一種優選的方案，所述細胞分裂蛋白引物儲備液，核酸染色液，無核酸酶水和反轉錄樣本的體積比為2～3：9～11：6～8：1。