[發明專利]橫紋肌肉瘤中F-circP3F的檢測試劑盒及方法

有效

• 申請號: 202210131469.3
• 申請日: 2022-02-14
• 公開（公告）號: CN114182023B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 李鋒;賈興元;文豪;宋凌勰;張瑩;封國生;袁海鑫;崔曉賓
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京八月瓜知識產權代理有限公司 11543
• 代理人: 袁曉雨

本發明涉及一種檢測橫紋肌肉瘤石蠟包埋組織中融合基因相關環狀RNA??F?circP3F的試劑盒，屬于生物醫學檢驗技術領域，包括檢測橫紋肌肉瘤的分子標志物F?circP3F和融合基因PAX3?FOXO1的試劑、引物組合物和探針；分子標志物F?circP3F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發明提供了基于一步法RT?PCR和qRT?PCR技術的檢測橫紋肌肉瘤石蠟包埋組織中F?circP3F的試劑盒和方法，可實現對石蠟組織中F?circP3F mRNA的絕對定量檢測，可操作性及重復性強，能夠用于批量檢測，靈敏度和特異性均較高，有利于橫紋肌肉瘤的診斷、分型及預后評估。

技術領域

本發明涉及生物醫學檢驗技術領域，尤其是涉及一種檢測橫紋肌肉瘤石蠟包埋組織中F-circP3F的檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma, RMS）是兒童和青少年最常見的軟組織惡性腫瘤，約占兒童所有軟組織惡性腫瘤的50%。根據臨床和組織形態特征可分為胚胎性（embryonal RMS，ERMS）、腺泡狀（alveolar RMS，ARMS）、梭形細胞（spindle cell RMS，SRMS）和多形性（pleomorphic RMS，PRMS）等四個主要類型。它們不僅在發病年齡、部位、組織形態等方面有差異，而且在治療、預后上也各不相同。

迄今的研究發現，不同亞型的RMS中存在兩類不同的分子遺傳學改變：腺泡狀RMS（ARMS）存在特異性染色體易位t (2;13) (q35;q14)、t (1;13) (q36;q14)及其融合基因PAX3/7-FOXO1、PAX3-NCOA1/2和PAX3-FOXO4等；梭形/硬化型RMS（SRMS）中不僅存在VGLL2-NCOA2基因重排，而且40-50%有MyoD1基因突變。融合基因PAX-FOXO1及其產物主要通過阻滯細胞周期、抑制細胞肌分化、增加細胞增殖侵襲遷移能力，并增強其下游靶基因和特定miRNA的表達，促進ARMS的發生發展。與融合基因陰性者相比，融合基因陽性RMS是一種高危性疾病，它對化療反應差，易轉移和復發，總體5年存活率低于50%，而轉移或復發患者的5年存活率低于20%，因此，確定有效的診斷和治療方法，提高生存率是急需解決的關鍵問題。

環狀RNA（circular RNA，circRNA）是1976年Sanger等人首先在植物感染的類病毒發現的閉合環狀非編碼RNA分子，具有環狀共價鍵結構，對外切酶具有較高的耐受性。由于其保守性、豐富性和特異性，cicRNA在轉錄后水平具有多種生物學功能并參與腫瘤發生：（1）充當miRNA海綿；（2）調控基因轉錄；（3）與RNA結合蛋白（RBP）相互作用；（4）翻譯成多肽。越來越多的證據表明，來自融合基因反剪接的環狀RNA是除融合蛋白以外參與腫瘤發生發展的另一個途徑。因此，檢測融合基因相關環狀RNA 作為分子標志物，有利于橫紋肌肉瘤的診斷、分型及預后評估。

在本申請中，申請人在運用RT-PCR技術擴增腺泡狀RMS中融合基因PAX3-FOXO1及其相關circ RNA時，通過優化引物設計和線性RNA消化，使用發散引物(Divergent primer)在腺泡狀RMS細胞系中擴增到一個陽性目的片段，通過對PCR產物Sanger測序并使用NCBI數據庫進行比對證實為融合基因PAX3-FOXO1相關環狀RNA（Fusion gene PAX3-FOXO1related circ RNA），將其命名為F-circP3F。由于此F-circP3F為國內外首次發現，申請人又設計引物成功擴增并經測序驗證了F-circP3F的全長核苷酸序列；circRNA-seq結果再次證實，PAX3-FOXO1陽性ARMS細胞中存在相同的F-circP3F。