[發(fā)明專利]一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的火木層孔菌遺傳轉(zhuǎn)化方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210127813.1
• 申請(qǐng)日: 2022-02-11
• 公開（公告）號(hào): CN114561419A
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳秀麗;劉成;馬鵬生;周麗;吳欣圓;劉小溪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧夏醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N1/21;C12N1/15;C12N15/54;C12R1/645;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 王灝增

1.一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的火木層孔菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)將火木層孔菌菌絲經(jīng)溶壁酶液酶解、純化得到火木層孔菌原生質(zhì)體，

2)以含有外源基因的重組根癌農(nóng)桿菌對(duì)步驟1)中得到的火木層孔菌原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化處理，

3)將處理后的火木層孔菌原生質(zhì)體進(jìn)行再生培養(yǎng)和抗性篩選培養(yǎng)，獲得整合外源基因的火木層孔菌轉(zhuǎn)化株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的火木層孔菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟1)中，溶壁酶液的加入量為每克濕菌絲加入2～10mL溶壁酶液；酶解條件為30～35℃酶解1.5～3小時(shí)；所述步驟1中的純化方法為將酶解液用G3砂芯漏斗過濾，濾液經(jīng)離心去上清液，再用0.5～0.8mol/L的滲透壓穩(wěn)定劑洗滌1～3次，得到純化的火木層孔菌原生質(zhì)體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的火木層孔菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟2)中的含有外源基因的重組根癌農(nóng)桿菌為將重組載體pCH-hph導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL-1中得到在真菌中表達(dá)的潮霉素篩選標(biāo)記的農(nóng)桿菌AGL-1-pCH-hph，所述重組載體pCH-hph為在pDHt2載體的EcoRI和SacI位點(diǎn)的序列替換為序列1所示的核苷酸序列，并保持其他序列不變，得到的重組載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的火木層孔菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟2)中的農(nóng)桿菌AGL-1-pCH-hph的構(gòu)建方法包括：

S1)將農(nóng)桿菌AGL-1的菌液接種在含利福平的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)；

S2)取步驟S1)中的培養(yǎng)液接種于利福平的LB液體培養(yǎng)中，培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.5，離心，用CaCl₂溶液懸浮菌體，得到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；

S3)取步驟S2)中的感受態(tài)細(xì)胞，加入重組載體pCH-hph，混勻，冷卻后熱擊，加不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，涂布于含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基平板，篩選抗性菌落，得到含pCH質(zhì)粒的AGL-1單克隆；

S4)將含pCH質(zhì)粒的AGL-1單克隆按1％的接種量接種于含利福平和卡那霉素的基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，用液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋至OD₆₀₀達(dá)到0.15，得到農(nóng)桿菌AGL-1-pCH-hph。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的火木層孔菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述含利福平的LB液體培養(yǎng)基是指在LB液體培養(yǎng)基中添加利福平，使混合物中利福平的濃度為50mg/L；所述LB液體培養(yǎng)基的配置方法為在950mL去離子水中加10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化鈉和1mL 1M NaOH，定容至1L,調(diào)PH為7.2，得到LB液體培養(yǎng)基。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的火木層孔菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟2)中的轉(zhuǎn)化處理的步驟為：取農(nóng)桿菌AGL-1-pCH-hph和純化的火木層孔菌原生質(zhì)體混勻涂布于固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；20～30℃培養(yǎng)2～3天，轉(zhuǎn)移至含潮霉素、頭孢霉素、鏈霉素和四環(huán)素的抗性篩選培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8～12天，得到火木層孔菌轉(zhuǎn)化株。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的火木層孔菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述含潮霉素、頭孢霉素、鏈霉素和四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基為在選擇培養(yǎng)基加入潮霉素、頭孢霉素、鏈霉素和四環(huán)素得到的混合溶液，所述混合溶液中，潮霉素的濃度為30mg/L；頭孢霉素的濃度為200μM；鏈霉素的濃度為100mg/L；四環(huán)素的濃度為50mg/L；所述抗性篩選培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，所述PDA培養(yǎng)基的配置方法為將200g去皮馬鈴薯，20g葡萄糖，15g瓊脂，加水定容至1L；。

8.一種與火木層孔菌遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)的生物材料，所述生物材料為權(quán)利要求3所述的重組載體pCH-hph，或者權(quán)利要求3所述的農(nóng)桿菌AGL-1-pCH-hph。

9.權(quán)利要求8所述的與火木層孔菌遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)的生物材料在火木層孔菌遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。