[發明專利]一種高效生產N-乙酰氨基葡萄糖的大腸桿菌及其應用

有效

• 申請號: 202210116458.8
• 申請日: 2022-02-07
• 公開（公告）號: CN114574410B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 劉龍;陳堅;盧健行;呂雪芹;盧偉;堵國成;張弘治;李江華;劉延峰;盧建功
• 申請（專利權）人: 山東潤德生物科技有限公司;江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/31;C12P19/26;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 夏蘇娟

本發明提供了一種高效生產N?乙酰氨基葡萄糖的大腸桿菌及其應用，屬于生物工程技術領域。本發明所述重組大腸桿菌以大腸桿菌E.coli?ATCC25947(DE3)為出發菌株，過表達具有若干個T7_lac啟動子控制的gna1基因與具有若干個T7_lac啟動子控制的glmS基因，并敲除manX基因、manY基因、manZ基因、nagA基因、nagB基因、nagE基因、poxB基因和ldhA基因所得，提高了N?乙酰氨基葡萄糖在胞外的積累量，其濃度最高可達180g/L，葡萄糖轉化率56％，不產生乙酸和乳酸副產物，為進一步代謝工程改造大腸桿菌生產氨基葡萄糖奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，尤其是指一種高效生產N-乙酰氨基葡萄糖的大腸桿菌及其應用。

背景技術

乙酰氨基葡萄糖是生物體內的一種單糖，廣泛存在于細菌、酵母、霉菌、植物以及動物體內。在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對修復和維持軟骨及關節組織功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被廣泛作為藥物和營養膳食添加來治療和修復關節損傷。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妝品和制藥領域也具有諸多應用。

現如今微生物發酵法是國內外生產GlcNAc的主要方法。所使用的基因工程菌主要為大腸桿菌(Escherichia?coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)。通過在這些菌株中引入氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glmS)和氨基葡萄糖6-磷酸N-乙酰轉移酶(gna1)編碼基因，以葡萄糖為原料，進行乙酰氨基葡萄糖的微生物合成。

對乙酰氨糖的生物合成研究表明，在大腸桿菌中，阻斷GlcN的分解代謝途徑以及異源表達gna1，定向進化內源glmS，此時GlcNAc產量達到110g/L，對葡萄糖轉化率45％。在枯草芽孢桿菌中，采用理性代謝工程手段以及動態調控策略對代謝流進行了優化，GlcNAc產量達到了131.6g/L，對葡萄糖轉化率38％。然而以上基因工程菌株中均存在較多副產物途徑，導致了產量及轉化率較低，工業化成本高。因此，進一步提高產量及轉化率以降低生產成本成為目前微生物發酵法生產乙酰氨糖的重要問題。

發明內容

為了解決上述問題，本發明一種高效生產N-乙酰氨基葡萄糖的大腸桿菌及其應用。為了提高乙酰氨基葡萄糖的產量和對葡萄糖的轉化率，本發明通過阻斷大腸桿菌細胞對乙酰氨糖的利用，過表達glmS及外源gna1，并且敲除了丙酮酸氧化酶(poxB)和乳酸脫氫酶(ldhA)，發酵過程中共同使用一定濃度的IPTG和乳糖進行誘導，從而提高了大腸桿菌生產乙酰氨基葡萄糖的能力，減少了副產物乙酸及乳酸的產生。具有重要的經濟價值和社會意義。

本發明的第一個目的是提供一種重組大腸桿菌，以大腸桿菌為出發菌株，過表達具有若干個T7_lac啟動子控制的gna1基因與具有若干個T7_lac啟動子控制的glmS基因，并敲除manX基因、manY基因、manZ基因、nagA基因、nagB基因、nagE基因、poxB基因和ldhA基因所得。

在本發明的一個實施例中，重組大腸桿菌以大腸桿菌E.coli?ATCC25947(DE3)為出發菌株，過表達具有至少兩個T7_lac啟動子控制的gna1基因與具有至少一個T7_lac啟動子控制的glmS基因，并敲除manX基因、manY基因、manZ基因、nagA基因、nagB基因、nagE基因、poxB基因和ldhA基因所得。

為了進一步提高GlcNAc的產量及轉化率，選取了E.coli?ATCC25947(DE3)為出發菌株，通過CRISPR/Cas9系統敲除了甘露糖轉運子基因簇manXYZ和乙酰氨糖轉運子基因簇nagABE，同時在這兩個位點分別整合了T7_lac啟動子控制下的glmS和gna1，并在巖藻糖異構酶和激酶fucIK位點增加了一個拷貝的T7lac-gna1。又進一步敲除了丙酮酸氧化酶poxB和乳酸脫氫酶ldhA。