[發明專利]重組人源巖藻糖基轉移酶變異體及應用

有效

• 申請號: 202210115221.8
• 申請日: 2022-02-06
• 公開（公告）號: CN114369584B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發明（設計）人: 王冀姝;黃滔
• 申請（專利權）人: 北京睿脈醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/85;C12N5/10;C12N5/00;A61K39/395;A61P35/00;A61P29/00;A61P3/00
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

本發明公開了一組重組人源巖藻糖基轉移酶變異體，通過對特定位點和片段進行替換、增減、或刪除后，改變巖藻糖基轉移活性，顯著提高轉移分子量大于100KD的含有鳥苷二磷酸巖藻糖(GDP?Fucose)的供體分子。在所述酶突變體的作用下，可以將大分子量的供體分子（例如偶聯了抗體分子或者重組蛋白的GDP?Fucose）轉移至受體GlcNAc（N?乙酰氨基葡萄糖）和LacNac(N?乙酰乳糖胺)。受體可存在于大分子物質和細胞膜表面。本發明還公開了巖藻糖基轉移酶突變體在分子標記和活體細胞標記中的應用。

技術領域

本發明涉及一種蛋白突變體，屬于多肽技術領域。

背景技術

糖基化是碳水化合物與目標分子（通常為蛋白質和脂質）共價連接的過程，蛋白質分子的糖基化是最豐富的翻譯后修飾之一，這種修飾具有多種功能，例如，參與蛋白質分子的正確折疊，調節蛋白質的熱力學和動力學穩定性，參與分子間相互作用和細胞間粘附，參與免疫識別或者免疫逃逸。與DNA轉錄或蛋白質翻譯不同，蛋白質的糖基化過程沒有模板，是一種是酶促反應，供體分子通常是一種活化的核苷酸糖，在糖基轉移酶的作用下，對受體位點（羥基或其它官能團）進行特異的糖綴合物的反應。巖藻糖作為糖蛋白中糖鏈的組成部分，廣泛存在于各類細胞表面的質膜上。巖藻糖基轉移酶是將L-巖藻糖從GDP-巖藻糖（鳥苷二磷酸巖藻糖）供體底物轉移到受體底物的酶。據目前的各種文獻報道，巖藻糖基轉移酶的主要供體底物都是分子量比較小的GDP-巖藻糖。在巖藻糖基轉移酶的作用下，將巖藻糖苷轉移至哺乳細胞糖蛋白蛋白N-多糖上。人源的巖藻糖基轉移酶一共有11種，分別為FUT1;FUT2;?FUT3;?FUT4;?FUT5;?FUT6;?FUT7;?FUT8;?FUT9;?FUT10;?FUT11。巖藻糖轉移酶屬于II型一次跨膜蛋白，主要存在于高爾基體內。原核生物的巖藻糖基轉移酶，目前經過驗證的主要來自幽門螺桿菌（Helicobacter?pylori），包括6條序列（Uniprot：http://www.cazy.org/GT10.html）。

細胞表面的分子決定了細胞如何與其它細胞以及周圍環境相互作用。腫瘤的治療性抗體例如抗-CD20,?抗-VEGFR等通過結合T淋巴細胞和NK細胞表面的FcgR，同時結合腫瘤細胞表面的抗原，使得T和NK細胞發揮腫瘤殺傷作用（ADCC）。受其啟發，腫瘤免疫療法近年來有了突變進展——嵌合抗原受體T細胞免疫療法，?Chimeric?Antigen?Receptor?T-CellImmunotherapy?（CAR-T），其中Kymriah是第一款被美國批準用于治療B細胞前體急性淋巴細胞白血病。這是一種治療腫瘤的新型精準靶向療法，其用生物技術把辨識癌細胞表面CD19抗原的CAR基因插到T細胞膜表面上，直接識別腫瘤細胞，激活T細胞進行腫瘤殺傷。但CAR-T的技術工藝復雜，價格昂貴。類似CAR-T這樣的細胞工程的主要技術挑戰是在不干擾細胞內源性功能的情況下賦予被操縱細胞新的特性。作為目前最常見和最穩健的細胞工程方法，首先受到技術復雜性和安全問題的限制，如原代細胞病毒轉導效率的再現性不一致、CAR基因的異質表達水平，以及內源性基因被破壞的可能性。因此，使用化學生物學工具直接修飾細胞表面已成為細胞治療的一種補充和普遍適用的方法。其中包括Bertozzi等人開發的代謝寡糖修飾法（MOE）和細菌轉肽酶sortases催化的轉肽反應。（Stephan,等.NanoToday?2011,?6,?309?325.；Griffin等.?Cell?Chem.?Biol.?2016,?23,?108?121.?；Hudak等?Chem.?Biol.?2014,?21,?16?37.?；Bi,?X等.?Engineering.?Chem.?-?Eur.?J.?2018,24,?8042?8050.））此外，Wu等利用幽門螺桿菌的巖藻糖基轉移酶成功地將抗體類大分子蛋白轉移到細胞膜表面的多糖上，例如LacNAc和α2,3?sialyl?LacNAc。利用這種技術，Wu等構建了兩種類型的工程細胞——使用自然殺傷細胞系（NK-92MI）和小鼠原代CD8⁺OT-1T細胞，通過巖藻糖基轉移酶將Her2抗體和PD-L1的抗體分別轉移至NK-92MI和CD8⁺OT-1T細胞，并在小鼠模型中展示了特異性腫瘤靶向性和對抗腫瘤細胞產生的抑制信號（參見Li?J,等.ACS?Cent?Sci.?2018?Dec?26;4(12):1633-1641.?）。因此，利用巖藻糖基轉移酶將與供體底物相結合的目的分子標記到攜帶有受體底物的目的細胞將使得諸如CAR-T這樣的細胞治療的效果得到大幅提升。