[發明專利]一種糖醛酸脫氫酶突變體及其在制備糖二酸中的應用

在審

• 申請號: 202210109770.4
• 申請日: 2022-01-28
• 公開（公告）號: CN114426957A
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 薛業敏;謝方;趙紅陽;薛夢柯;封嗣中
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/58;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

1.一種糖醛酸脫氫酶突變體，其特征在于，所述突變體包括A97Y、A97H、L104F、A110V、T170V、E231K、E242C、E242N、A97H/L104F、A97H/E231K、L104F/E231K、A110V/T170V、A97H/L104F/E231K、A110V/T170V/E242N、A97H/E231K/E242N中的任意一種或者多種，所述突變體對應的野生型氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種糖醛酸脫氫酶突變體，其特征在于，所述突變體對應的野生型的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述突變體A97Y，即第97位丙氨酸密碼子GCG突變為了酪氨酸密碼子TAT；所述突變體A97H，即第97位丙氨酸密碼子GCG突變為了組氨酸密碼子CAT；所述突變體L104F，即第104位亮氨酸密碼子CTG突變為了苯丙氨酸密碼子TTT；所述突變體A110V，即第110位丙氨酸密碼子GCG突變為了纈氨酸密碼子GTT；所述突變體T170V，即第170位蘇氨酸密碼子ACC突變為了纈氨酸密碼子GTT；所述突變體E231K，即第231位谷氨酸密碼子GAA突變為了賴氨酸密碼子AAA；所述突變體E242C，即第242位谷氨酸密碼子GAA突變為了半胱氨酸密碼子TGT；所述突變體E242N，即第242位谷氨酸密碼子GAA突變為了天冬酰胺密碼子AAT；所述突變體A97H/L104F，即第97位丙氨酸密碼子GCG突變為了組氨酸密碼子CAT，同時第104位亮氨酸密碼子CTG突變為了苯丙氨酸密碼子TTT；所述突變體A97H/E231K，即第97位丙氨酸密碼子GCG突變為了組氨酸密碼子CAT，同時第231位谷氨酸密碼子GAA突變為了賴氨酸密碼子AAA；所述突變體L104F/E231K，即第104位亮氨酸密碼子CTG突變為了苯丙氨酸密碼子TTT，同時第231位谷氨酸密碼子GAA突變為了賴氨酸密碼子AAA；所述突變體A110V/T170V，即第110位丙氨酸密碼子GCG突變為了纈氨酸密碼子GTT，同時第170位蘇氨酸密碼子ACC突變為了纈氨酸密碼子GTT；所述突變體A97H/L104F/E231K，即第97位丙氨酸密碼子GCG突變為了組氨酸密碼子CAT、第104位亮氨酸密碼子CTG突變為了苯丙氨酸密碼子TTT且第231位谷氨酸密碼子GAA突變為了賴氨酸密碼子AAA；所述突變體A110V/T170V/E242N，即第110位丙氨酸密碼子GCG突變為了纈氨酸密碼子GTT、第170位蘇氨酸密碼子ACC突變為了纈氨酸密碼子GTT且第242位谷氨酸密碼子GAA突變為了天冬酰胺密碼子AAT；所述突變體A97H/E231K/E242N，即第97位丙氨酸密碼子GCG突變為了組氨酸密碼子CAT、第231位谷氨酸密碼子GAA突變為了賴氨酸密碼子AAA且第242位谷氨酸密碼子GAA突變為了天冬酰胺密碼子AAT。

3.一種重組質粒，其特征在于，所述重組質粒優選攜帶權利要求2任意所述的突變體的基因。

4.根據權利要求3所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒的表達載體為pET-20b(+)質粒。

5.一種重組菌，其特征在于，所述重組菌攜帶權利要求2任一所述的突變體基因或權利要求3的所述重組質粒。

6.根據權利要求3所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌宿主為E.coli BL21(DE3)。

7.一種權利要求1或者2所述的糖醛酸脫氫酶突變體或者權利要求3所述的重組質粒或者權利要求5所述的重組菌在生產糖二酸中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的應用包括如下步驟：構建反應體系，底物為糖醛酸，加入糖醛酸脫氫酶突變體，在緩沖液下反應得到轉化液，其中含有糖二酸。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，在緩沖液下反應得到轉化液其轉化溫度為45～55℃，pH為7.0～7.5，轉化時間為1～6h，底物糖醛酸濃度為0.2～100mg/mL，酶添加量為0.1～50U/mL。

10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，重組菌在生產糖二酸過程為：將大腸桿菌工程菌發酵培養，獲得種子液；將種子液接種至發酵培養基內進行高密度培養，然后向其中加入誘導劑，繼續培養，獲得發酵液；將發酵液離心收集菌體，洗滌，離心后再用洗滌液重懸細胞；將透性化試劑加入細胞懸液處理后離心收集細胞，洗滌重懸后，再次離心；將細胞加入反應液進行全細胞轉化，獲得糖二酸。