[發(fā)明專利]一種芯片表面固相引物封堵效率的檢測方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210104007.2
• 申請(qǐng)日: 2022-01-28
• 公開（公告）號(hào): CN114350775A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 康力;孫文婷;趙玉蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 賽納生物科技(北京)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 北京嘉途睿知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11793
• 代理人: 李鵬

1.一種芯片表面固相引物封堵效率的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將與固載在芯片上的引物互補(bǔ)的模板雜交到芯片上；所述模板在引物的3’端延伸出n nt，以供引物延伸，所述n為大于等于2的整數(shù)；

(2)芯片表面進(jìn)行熒光發(fā)生測序反應(yīng)，使每條引物上只延伸一個(gè)堿基，得到平均熒光增值int1；

(3)解旋；用末端轉(zhuǎn)移酶TdT和ddNTP對(duì)引物進(jìn)行封端；

(4)上述封端反應(yīng)處理后的芯片，再次與所述模板雜交，進(jìn)行熒光發(fā)生測序，加入的底物中含有A、C、G、T四種堿基，得到平均熒光增值int2；

(5)封堵效率由以下公式計(jì)算得到：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的檢測方法，其特征在于：所述引物的長度為20～45nt。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的檢測方法，其特征在于：所述n為大于等于2的整數(shù)，優(yōu)選10～20。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的檢測方法，其特征在于：所述使每條引物上只延伸一個(gè)堿基的具體方式為：測序反應(yīng)時(shí)，加入的底物中僅含一種堿基，且該堿基為所述引物所延伸的第一個(gè)堿基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的檢測方法，其特征在于：所述封端所用試劑的組分為：TdT酶4μL，10x緩沖液40μL，CoCl₂ 40μL，ddNTP(10mM)8μL，水308μL，總體積400μL；

或：TdT酶2.2μL，10x緩沖液40μL，CoCl₂ 40μL，ddNTP(10mM)8μL，水309.8μL，總體積400μL；

或：TdT酶20μL，10x緩沖液40μL，CoCl₂ 40μL，ddNTP(10mM)8μL，甘油160μL，水132μL，總體積400μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的檢測方法，其特征在于：所述模板雜交的流程為：96℃，30s；-0.05℃/s；40℃，10s；25℃，forever。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的檢測方法，其特征在于：封端反應(yīng)后進(jìn)行熒光發(fā)生測序反應(yīng)時(shí)，加入的測序反應(yīng)液由以下組分組成：熒光基團(tuán)修飾的dA堿基，熒光基團(tuán)修飾的dT堿基，熒光基團(tuán)修飾的dC堿基，熒光基團(tuán)修飾的dG堿基，熒光發(fā)生測序酶混合液和熒光發(fā)生測序緩沖液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的檢測方法，其特征在于：所述芯片表面固載有微球，所述微球上連接有引物。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的芯片表面固相引物封堵效率的檢測方法，其特征在于：所述微球上有生物素作為固載用的基團(tuán)，所述芯片上有修飾的鏈霉親和素，通過生物素和鏈霉親和素的特異性反應(yīng)將微球連接到芯片上。