[發明專利]一種基于PFOR酶活性導向的FMT供體篩選方法及其應用

有效

• 申請號: 202210099285.3
• 申請日: 2022-01-27
• 公開（公告）號: CN114480562B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發明（設計）人: 梁思成;肖麗君;呂沐瀚;陽泰;鐘曉琳;齊曉怡;鄧明明
• 申請（專利權）人: 西南醫科大學附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C12Q1/18;C12R1/145
• 代理公司: 成都君合集專利代理事務所(普通合伙) 51228
• 代理人: 何巍

1.一種基于PFOR酶活性導向的FMT供體篩選方法，其特征在于，以艱難梭菌體內的PFOR酶為靶點，通過測試FMT供體提供的糞菌液對PFOR酶的抑制率，篩選預測和/或評價FMT對于艱難梭菌感染的治療效果，具體包括以下步驟：

（1）培養帶有PFOR酶質粒的大腸桿菌；

（2）誘導帶有PFOR酶質粒的大腸桿菌產生PFOR酶；

（3）提取大腸桿菌產生PFOR酶；

（4）制備FMT供者所提供的糞菌液；

（5）配制PFOR酶的反應體系，通過體外實驗，檢測FMT供者所提供的糞菌液在PFOR酶的反應體系中，對PFOR酶的抑制情況；

（6）根據FMT供體提供的糞菌液對PFOR酶的抑制率，篩選預測和/或評價FMT對于艱難梭菌感染的治療效果。

2.根據權利要求1所述的一種基于PFOR酶活性導向的FMT供體篩選方法，其特征在于，所述步驟（1）中，培養帶有PFOR酶質粒的大腸桿菌的具體如下：

（1.1）制備LB培養基，具體包括液體培養基和固定培養基：

（1.1.1）液體培養基的配制：將5g?LB肉湯粉末溶于500ml蒸餾水，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃高壓滅菌15min，培養瓶內液體體積不超過瓶本身量程的1/3，待其冷卻后加入氨芐青霉素，使其終濃度為100μg/mL，混勻即可；

（1.?1.?2）固體培養基的配制：將3.5g?LB瓊脂粉末溶于100ml蒸餾水，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃高壓滅菌15min，65℃將培養基從高溫滅菌鍋中取出，在固體培養基凝固之前加入終濃度為100μg/mL氨芐青霉素后混勻，然后將培養基倒入培養皿中，靜置待其冷卻凝固；

（1.2）選取帶有PFOR酶質粒的大腸桿菌進行平板接種：挑取單菌落，在已加入氨芐青霉素的固體培養基中進行平板劃線，置于細菌培養箱中，37℃，培養12小時左右；

（1.3）培養12小時后，在已經生長細菌得到平板上挑取單菌落到含有50ML已加入氨芐青霉素的液體培養基的離心管中，放在震蕩培養箱中，37℃，220rpm,200min，震蕩200分鐘后，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進行誘導，IPTG終濃度為0.5mMol/ml，置于震蕩培養箱中，25℃，220rpm，20h。

3.根據權利要求1所述的一種基于PFOR酶活性導向的FMT供體篩選方法，其特征在于，所述步驟（2）中，誘導帶有PFOR酶質粒的大腸桿菌產生PFOR酶的具體過程為：使用100μg/ml濃度氨芐青霉素誘導大腸桿菌質粒表達，使用終濃度為0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導PFOR酶的產生。

4.根據權利要求1所述的一種基于PFOR酶活性導向的FMT供體篩選方法，其特征在于，所述步驟（3）中，提取大腸桿菌產生PFOR酶的具體過程為：取50ml誘導菌液，12000g，4℃，5min，離心去上清；純水等體積重懸，再次離心去上清；然后10mL純水重懸，10mL菌液冰上400W超聲5s，間隔5s，持續10min，所獲得的溶液即含有PFOR的粗酶液。

5.根據權利要求1所述的一種基于PFOR酶活性導向的FMT供體篩選方法，其特征在于，所述步驟（4）中，制備FMT供者所提供的糞菌液的具體過程為，挑選健康狀況、飲食習慣良好的FMT供者既往提供的糞便，將其均質，在最終濃度為50mg糞便/mL的無菌鹽水中稀釋，收集的樣本以100g離心2分鐘，收集上清液并通過70μm和0.22μm濾膜，收集上清。

6.根據權利要求1所述的一種基于PFOR酶活性導向的FMT供體篩選方法，其特征在于，所述步驟（5）中，PFOR酶的反應體系具體為，pH=7.4的100mM磷酸鉀緩沖液、10mM丙酮酸鈉、ε=9.2mM^-1·cm^-1at546nm的5mM1,1'-二芐基-4,4'-聯吡啶鎓鹽二氯化物水合物、0.18mM輔酶A、1mMMgCl₂。

7.根據權利要求1所述的一種基于PFOR酶活性導向的FMT供體篩選方法，其特征在于，所述步驟（5）中，通過體外實驗檢測FMT供者所提供的糞菌液對PFOR酶抑制情況的具體過程為：在PFOR酶的反應體系中加入50μL粗酶液和10μL糞無菌液，定容至200μL。