[發明專利]一種發酵生產α-檀香烯的酵母工程菌及其應用

在審

• 申請號: 202210093958.4
• 申請日: 2022-01-26
• 公開（公告）號: CN114507613A
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 連佳長;左一萌;程錦濤
• 申請（專利權）人: 浙江大學杭州國際科創中心
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/52;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/81;C12P15/00;C12R1/84;C12R1/865;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種發酵生產α?檀香烯的酵母工程菌及其應用，屬于生物工程領域。以酵母作為出發菌株，通過導入基因構建獲得所述發酵生產α?檀香烯的酵母工程菌。本發明的酵母工程菌可以高效生產α?檀香烯，其搖瓶發酵產量近3.0g/L，1L發酵罐發酵產量最高可達15g/L。通過高表達代謝途徑中關鍵限速酶、增強前體供應以及多拷貝策略，提高α?檀香烯生物合成途徑中的代謝通量，利用畢赤酵母高效生成α?檀香烯，具有周期短、環保和節約資源的特點。本發明高產α?檀香烯的酵母工程菌具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種發酵生產α-檀香烯的酵母工程菌及其應用。

背景技術

檀香烯，分子式為C₁₅H₂₄，屬于雙環倍半萜類化合物。有α-檀香烯和β-檀香烯兩種異構體。α-檀香烯沸點252℃(100.39kPa)，存在于檀香木揮發油中。α-檀香烯作為檀香精油的主要成分之一，芳香味持久，被廣泛應用于香精、香料行業，還具有抗菌、抗氧化和抗腫瘤等藥理活性，又可用作名貴的保健藥品。

天然的檀香油主要來自于檀香心材部分，通過有機試劑萃取，蒸餾等提取手段制備天然的檀香精油，主要用水蒸氣蒸餾法，乙醚浸漬法，溶劑回流法等，不同的提取方法對精油提取量也不相同。由于檀香木的產地不同，品種不同等原因，檀香精油的成分差異較大，且結香效果也不一致，因此無法控制檀香精油的標準。除此之外，檀香由于其特殊的生長特性以及心材成熟周期較長的問題，天然的檀香木資源日漸枯竭。

隨著人類生活水平的不斷提高，對檀香產品的需求量也不斷增加，早期天然的檀香資源由于受到人類不合理的砍伐利用，消耗殆盡，而檀香天然林的更新時間長達30年甚至更長，這些因素使得檀香這一珍貴樹種的價格節節攀升，無法滿足日益增長的市場需求。

生物轉化法沒有諸多條件的限制且綠色環保，近年來，隨著合成生物學技術的發展，如果采用微生物細胞工廠異源生物合成檀香烯，則能提高效率、降低成本、打破自然條件限制而有效緩解檀香精油的供需矛盾。

目前已經有文獻報道了檀香類植物合成α-檀香烯的關鍵基因，這為異源合成α-檀香烯奠定了良好的基礎。隨著合成生物學的發展，許多的天然產物能夠在畢赤酵母體內表達，像萜類、黃酮類等物質。畢赤酵母作為公認的安全菌株，多年來的研究已經對其遺傳背景，代謝通路，調控機理有了很好的認識。同時，畢赤酵母是真核生物，且生長速度快，環境耐受性高，發酵條件簡單等，現在可以廣泛作為理想的宿主菌來表達異源蛋白及生產生物基化合物。

盡管檀香烯有眾多的應用前景，但是目前其產量低限制了其在不同領域的應用。通過微生物合成植物源天然產物是一種非常環保而且高效的方式，目前暫未有利用畢赤酵母細胞工廠生產檀香烯的相關報道。

發明內容

為了解決現有技術中的不足，本發明提供了一種發酵生產α-檀香烯的酵母工程菌及其應用。

酵母工程菌株首先利用基因編輯技術高表達檀香烯合酶SAS，其次，通過高表達3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶1tHMG1以解除甲羥戊酸途徑的限速步驟，再通過高表達途徑限速酶異戊烯基焦磷酸異構酶IDI1和法尼基焦磷酸合成酶ERG20提高代謝通量，然后高表達乙酰輔酶A合酶ACS，最后增加SAS拷貝數獲得。

本發明提供了一種發酵生產α-檀香烯的酵母工程菌，以酵母作為出發菌株，通過導入基因構建獲得所述酵母工程菌，所述導入基因包括以下任意一組：

(1)檀香烯合酶SAS的編碼基因、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶1tHMG1的編碼基因、異戊烯基焦磷酸異構酶IDI1的編碼基因、法尼基焦磷酸合成酶ERG20的編碼基因和乙酰輔酶A合酶ACS的編碼基因；

(2)檀香烯合酶SAS的編碼基因；