[發明專利]一種副豬嗜桿菌佐劑疫苗的制備方法

在審

• 申請號: 202210088216.2
• 申請日: 2022-01-25
• 公開（公告）號: CN114404583A
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 李曉華;劉棟;薛少華;龍凡利;梁蓉娟;鄭新添
• 申請（專利權）人: 龍巖學院
• 主分類號: A61K39/102
• 分類號: A61K39/102;A61K39/39;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/31;C12P21/02;C07K14/285;C07K1/14;C07K1/34;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

1.一種副豬嗜桿菌佐劑疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）HPS OMP5 PCR引物設計與合成；

（2）HPS OMP5 基因的克隆及表達載體構建 ；

（3）重組 pET-28a-OMP5 融合蛋白的誘導表達及蛋白的純化檢測；

（4）副豬嗜血桿菌超聲波破碎抗原的制備；

（5）免疫刺激復合物基質的制備與鑒定；

所述免疫刺激復合物基質的制備與鑒定步驟如下：在獲得免疫刺激物質時，首先將磷脂酰膽堿和膽固醇加至20% mega-10中，使得其完全溶解后分裝并處于低溫環境中儲存，隨后將0.1g QuilA溶于5mL pH為7.2的PBS緩沖液中，溶液終濃度為20mg/mL；取10mg/mL的OMP5 1mL加入非離子活性劑mega-10，使其終濃度為2%，37℃處理12h-18h，使其裂解；隨后將其加入脂類貯備液0.1mL和QuilA 5mL，搖勻后于RT下裂解240min；冰浴超聲處理，室溫下作用1.5h，隨后將其處于4℃的環境下放置3天，在前兩天將其放置在12000分子量的透析袋，最后一天用30000分子量的透析袋，用0.22μL過濾器過濾；取20μL采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定ISCOM-OMP5中的蛋白含量，取樣品進行磷鎢酸負染，于透射電鏡下觀察，過濾除菌后4℃保存。

2.根據權利要求1所述的一種副豬嗜桿菌佐劑疫苗的制備方法，其特征在于，所述PCR引物設計與合成的步驟如下：根據HPSOMP5基因序列，用生物軟件 Premier Primer5.0 設計1對特異性引物P1/P2，擴增 HPS OMP5 的全基因；

P1:CAACCGTAATAGCGTGACCT；

P2:CACTTCTTTACTACCCTGAACCT。

3.根據權利要求2所述的一種副豬嗜桿菌佐劑疫苗的制備方法，其特征在于，所述HPSOMP5 基因的克隆及表達載體構建步驟如下： 運用特異性引物P1/P2，按照分子克隆方式針對載體進行克隆，隨后采用PCR方法從克隆質粒pMD18T-OMP5 中擴增出副豬嗜血桿菌OMP5基因，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，將基因亞克隆到原核表達載體 pET-28a（+）中，構建重組表達載體，并進行 PCR 鑒定和酶切鑒定。

4.根據權利要求3所述的一種副豬嗜桿菌佐劑疫苗的制備方法，其特征在于，所述重組pET-28a-OMP5 融合蛋白的誘導表達及蛋白的純化檢測步驟如下：將陽性重組表達質粒pET-28a-OMP5接種到相應抗性的LB平板培養基上，37℃過夜培養，從LB培養基上挑選單菌落接種到已加入相應抗性的5ml的LB液體培養基中，200 rpm，37℃過夜培養，將過夜培養的菌液按接種量150-200μl接種于已加入相應抗性的200ml LB液體培養基中，在37℃，200rpm條件下培養至菌液OD600為0.6-0.8，加入終濃度0.4mM 的IPTG開始誘導表達，在200rpm，37℃條件下培養至菌液OD600為1.48-1.52左右，開始收菌，菌液離心，去上清，菌體用10ml包涵體緩沖液重懸，離心，去上清，菌體用于包涵體蛋白的純化。

5.根據權利要求4所述的一種副豬嗜桿菌佐劑疫苗的制備方法，其特征在于，所述超聲波破碎抗原的制備步驟如下：將步驟（3）制備得到的菌體用10ml 包涵體緩沖液重懸，在4℃條件下超聲破碎，直至菌液透明結束；超聲后在4℃條件下離心，取上清20μl，留樣電泳，沉淀用10ml包涵體緩沖液重懸并離心去上清；用10ml包涵體洗滌液將裂解后的沉淀重懸，離心，收集沉淀，再用包涵體洗滌液重懸，離心，如此重復3次操作，充分洗去包涵體中的水溶性蛋白，最后一次洗滌收集到的沉淀，用10ml包涵體溶解液重懸，吹打混勻并在斡旋儀上振動使得包涵體蛋白充分溶解，然后在離心，取上清20μl進行電泳；將10ml上清置于透析袋中密封，放入到裝有400ml外圍透析液的燒杯中，置于4℃，充分平衡；然后用蠕動泵向外圍透析液中逐漸緩慢滴加清水，直至外圍透析液被稀釋10倍，將第一次透析后的樣品放入二次透析液中透析至蛋白液中尿素濃度低于0.04M，取樣測蛋白濃度、電泳，最后將復性成功的蛋白樣品分裝保存于-20℃冰箱備用。

6.根據權利要求5所述的一種副豬嗜桿菌佐劑疫苗的制備方法，其特征在于，超聲破碎的步驟如下：超聲3s，停6s，振幅38%，超聲15min，此步驟均在冰浴情況下進行，直至菌液透明結束；第一次透析的時間不少于8h，第二次透析的時間為3-4 h。