[發明專利]基于點擊化學和ARGET-ATRP放大策略的電致化學發光檢測試劑盒及方法

有效

• 申請號: 202210085879.9
• 申請日: 2022-01-25
• 公開（公告）號: CN114410749B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發明（設計）人: 陳璐瑤;楊昊源;王劍鋒;李培培;郭亮;李曉飛;楊懷霞
• 申請（專利權）人: 河南中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/70;G01N21/76;C12R1/94
• 代理公司: 鄭州中鼎萬策專利代理事務所(普通合伙) 41179
• 代理人: 徐文婷

1.一種基于點擊化學和ARGET-ATRP放大策略的電致化學發光檢測試劑盒，其特征在于，包括以下原料：金電極、hairpin DNA、TCEP、MCH、魯米諾、PBIB、AA、CuSO₄、BPDS、CuBr₂/ME₆TREN、NAS。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括超純水、乙醇、DEPC水、DMSO和H₂O₂。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，部分原料使用時需配制成溶液，其中，hairpin DNA溶液的濃度為2μM，TCEP溶液濃度為10mM，MCH溶液的濃度為2mM，魯米諾溶液的濃度為20mM，PBIB溶液的濃度為10mM，AA溶液的濃度為2mM，CuSO₄溶液的濃度為2mM，BPDS溶液的濃度為2mM，CuBr₂/ME₆TREN溶液的濃度為10mM，NAS溶液的濃度為10mM，H₂O₂溶液的濃度為10mM。

4.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，

發夾DNA的序列為5′-SH-(CH₂)₆-CCACGCAGACACACGCTCACACCTCCGTGG-N₃-3′。

5.一種檢測煙草花葉病毒RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

①將hairpin DNA溶液滴加到金電極表面，在室溫下放置過夜，清洗；

②將步驟①的電極浸泡在MCH溶液中，反應，清洗，吹干；

③將待檢測樣品溶液滴加到步驟②電極表面，孵育，洗滌；

④將步驟③的電極浸入點擊化學反應溶液中，孵育，清洗；

⑤將步驟④的電極放置放入ARGET-ATRP反應溶液中，孵育，清洗；

⑥將步驟⑤的電極浸入魯米諾溶液中孵育；

⑦將步驟⑥的電極放置在H₂O₂溶液中測定其發光強度。

6.根據權利要求5所述檢測煙草花葉病毒RNA的方法，其特征在于，hairpin DNA溶液的制備方法為：

①將hairpin DNA加熱保溫后，冷卻；

②加入等體積TCEP溶液，避光振搖，得到具有莖環結構的hairpin DNA溶液；

其中，hairpin DNA的加熱溫度為95℃，加熱時間為10min，加熱速度為1.6℃/s，冷卻至25℃。

7.根據權利要求5所述檢測煙草花葉病毒RNA的方法，其特征在于，先將金電極進行預處理，預處理方法為：將金電極打磨至鏡面，清洗，吹干，備用。

8.根據權利要求5所述檢測煙草花葉病毒RNA的方法，其特征在于，步驟②的避光振搖溫度為37℃，時間為3～6h；步驟②的反應溫度為37℃，時間為30～60min；步驟③的孵育溫度為37℃，時間為90～120min；步驟④的孵育溫度為37℃，時間為40～60min；步驟⑤的孵育溫度為37℃，時間為60～90min；步驟⑥的孵育溫度為37℃，時間為160～240min。

9.根據權利要求5所述檢測煙草花葉病毒RNA的方法，其特征在于，點擊化學反應溶液是由PBIB溶液、AA溶液和CuSO₄/BPDS溶液等體積混合制備而成；其中，CuSO₄/BPDS溶液是由CuSO₄溶液和BPDS溶液等體積混合制備而成；ARGET-ATRP反應溶液是由體積比7:1:1:1的DEPC水、AA溶液、CuBr₂/ME₆TREN溶液和NAS溶液混合制備而成。

10.一種如權利要求1所述試劑盒在煙草花葉病毒檢測中的應用。