[發(fā)明專利]生產(chǎn)L-纈氨酸的重組微生物及構(gòu)建方法、應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210084710.1
• 申請(qǐng)日: 2020-05-13
• 公開（公告）號(hào): CN114457123B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張學(xué)禮;郭恒華;劉萍萍;張冬竹;唐金磊;韓成秀;唐思青;劉樹蓬;馬延和
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽華恒生物科技股份有限公司;中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N1/21;C12P13/08;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

本發(fā)明涉及生產(chǎn)L?纈氨酸的重組微生物的構(gòu)建方法，通過向微生物中導(dǎo)入NADH依賴型乙酰羥酸異構(gòu)還原酶基因和NADH依賴型氨基酸脫氫酶基因，同時(shí)乙酰羥基還原異構(gòu)酶和氨基酸脫氫酶的活性增強(qiáng)，能夠提高大腸桿菌生產(chǎn)L?纈氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，且可實(shí)現(xiàn)一步法厭氧發(fā)酵L?纈氨酸。

本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?02010401422.5，申請(qǐng)日為2020年05月13日，發(fā)明名稱為“生產(chǎn)L-纈氨酸的重組微生物及構(gòu)建方法、應(yīng)用”的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-纈氨酸的重組微生物的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法獲得的重組微生物，具體是重組大腸桿菌，以及通過發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸的方法。

背景技術(shù)

L-纈氨酸作為三大支鏈氨基酸(Branched-chain?amino?acid，BCAA)的一種，屬于必需氨基酸，在人和動(dòng)物中不能合成，只能通過從外界補(bǔ)充獲得。目前，L-纈氨酸被廣泛用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，主要包括食品添加劑、營養(yǎng)增補(bǔ)液及風(fēng)味劑等；廣泛用于化妝品制備、以及用作抗生素或者除草劑前體等；另外，隨著對(duì)飼料質(zhì)量和配比需求的提高，在未來L-纈氨酸在飼料添加劑行業(yè)中的作用將越來越重要，需求量會(huì)越來越大，未來市場(chǎng)具有極大的潛力。微生物細(xì)胞可以直接合成L-纈氨酸，但胞內(nèi)大量反饋抑制等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極大地限制了野生細(xì)胞的生產(chǎn)能力。要想獲得能夠高效生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵菌株，必須有效解除微生物細(xì)胞這些自我調(diào)節(jié)機(jī)制。目前，世界范圍內(nèi)L-纈氨酸主要通過發(fā)酵法生產(chǎn)獲得。用于發(fā)酵的生產(chǎn)菌株多通過誘變而來，出發(fā)菌株主要包括谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、黃色短桿菌等。陳寧等以黃色短桿菌為出發(fā)菌株，使用原生質(zhì)體紫外誘變并結(jié)合DES化學(xué)誘變的策略，篩選獲得了一株L-纈氨酸高產(chǎn)菌TV2564。但是，傳統(tǒng)誘變獲得的菌株具有很強(qiáng)的隨機(jī)性，并且遺傳背景不清晰，副產(chǎn)物多，并且不容易進(jìn)一步通過改造獲得更加高產(chǎn)的菌株。

近年來，隨著合成生物學(xué)和代謝工程的迅速發(fā)展，通過遺傳改造獲得能夠高效生產(chǎn)L-纈氨酸、遺傳背景清晰、且易于培養(yǎng)的重組工程菌株應(yīng)運(yùn)而生并取得了很好的效果。Sang?Yup?Lee課題組2007年從大腸桿菌W3110出發(fā)，結(jié)合理性代謝工程、轉(zhuǎn)錄組分析和遺傳改造、以及基因敲除等手段獲得了一株能夠生產(chǎn)L-纈氨酸的工程菌。該菌株在好氧條件下批式培養(yǎng)(batch?culture)可以生產(chǎn)纈氨酸但其培養(yǎng)過程中需要持續(xù)通氧，且需添加L-異亮氨酸方能保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)。

謝希賢等整合枯草芽孢桿菌乙酰乳酸合酶的編碼基因alsS，解除了L-纈氨酸對(duì)合成通路的反饋抑制，同時(shí)整合大腸桿菌ppGpp3’-焦磷酸水解酶的突變基因spo?TM，增強(qiáng)了丙酮酸供應(yīng)，增強(qiáng)了出發(fā)菌株VHY03的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的水平。

目前公開報(bào)道的L-纈氨酸發(fā)酵生產(chǎn)多是通過好氧或者兩步法發(fā)酵實(shí)現(xiàn)的。但是好氧工藝在生產(chǎn)過程中需要用空氣，能耗很大；更關(guān)鍵的是，有相當(dāng)一部分碳源進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)從而被用于細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率比理論最大值要低很多。厭氧工藝和好氧相比，具有低能耗、高轉(zhuǎn)化率的優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)過程中不需要通空氣，大大節(jié)約能耗；產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率通常接近理論最大值。氨基酸生產(chǎn)的厭氧發(fā)酵最早是在丙氨酸生產(chǎn)過程中實(shí)現(xiàn)的，目前其他氨基酸的生產(chǎn)暫未有純厭氧發(fā)酵工藝的報(bào)道。此外，目前工程菌改造過程中關(guān)鍵基因的過表達(dá)都是通過在質(zhì)粒上實(shí)現(xiàn)的，這就導(dǎo)致發(fā)酵過程中需要添加抗生素維持質(zhì)粒存在，增加了生產(chǎn)成本并存在在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中質(zhì)粒丟失的風(fēng)險(xiǎn)。

因此，本領(lǐng)域仍需要提供穩(wěn)定、高產(chǎn)、節(jié)能、簡(jiǎn)便的生產(chǎn)L-纈氨酸的重組微生物以及相應(yīng)的L-纈氨酸的生產(chǎn)制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，原增強(qiáng)乙酰羥基還異構(gòu)酶和/或氨基酸脫氫酶的活性，能夠提高大腸桿菌生產(chǎn)L-纈氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，且可實(shí)現(xiàn)一步法厭氧發(fā)酵L-纈氨酸。

本發(fā)明的第一個(gè)方面，是提供一種L-纈氨酸的重組微生物的構(gòu)建方法，經(jīng)該方法獲得的重組微生物具有穩(wěn)定遺傳背景、且具備平衡的L-纈氨酸還原力，適宜一步法厭氧發(fā)酵。