[發明專利]一種基于固相載體的DNA分子信號擴增及核酸測序的方法

在審

• 申請號: 202210084194.2
• 申請日: 2022-01-21
• 公開（公告）號: CN114350773A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 周魏
• 申請（專利權）人: 深圳太古語科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 潘登

本發明公開了一種基于固相載體的DNA分子信號擴增及核酸測序的方法。所述方法包括：通過羧基與氨基的縮合反應，將羧基化的DNA引物固定于表面氨基化的固相載體上，向所述固相載體上加入環狀DNA文庫和擴增試劑，進行滾環擴增，所述DNA引物與所述環狀DNA文庫通過堿基互補的方式結合。本發明將DNA引物固定于固相載體上，利用滾環擴增將DNA擴增成線性的螺旋結構，避免了由于橋式PCR擴增成cluster引起的錯誤累積，提高測序準確性，亦降低因橋式PCR引起的較高duplicate比率，節約測序成本，同時，進行等溫DNA擴增，對設備要求低，可減少操作人員負擔，實現自動化制備。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種基于固相載體的DNA分子信號擴增及核酸測序的方法。

背景技術

高通量測序技術(High-throughput sequencing)又稱“下一代”測序技術(Next-generationsequencing technology)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。高通量測序的步驟包括樣品準備，文庫構建，測序反應和數據分析，高通量測序的文庫構建階段，可以通過PCR將文庫模版擴增數千倍，從而達到上機的文庫量，以便完成后續對基因組DNA序列的測定；在測序階段，單個DNA分子的信號難以檢測，需要通過擴增使單個DNA分子形成一簇(即cluster)或成球(DNB)，獲得足夠強度的信號，測序才能夠檢測到，對于核酸模板而言，有的二級結構復雜，有的熱穩定性不好，這些因素都會影響PCR擴增效率。

目前市場在測序階段進行DNA分子信號擴增的方式有通過擴增使單個DNA分子形成一簇，即cluster。橋式PCR擴增形成cluster這一過程的錯誤累積會降低DNA序列復制的保真性，影響低深度測序變異和低頻突變檢測的精準度和敏感度。由于建庫和測序的PCR擴增，會帶來較高的duplicate比率，造成DNA數據量浪費，從而增加測序成本。進行RNA測序時，因為難以區分是PCR duplicates還是RNA高表達形成的相同的模板，則無法去除duplicates，這將會影響轉錄組表達量的準確性，尤其是小、中等表達量的轉錄本的準確性。

另一種在測序階段獲得足夠強度的信號的方式是通過擴增使單個DNA分子形成DNA納米球，如CN113774120A公開一種DNB雙末端測序方法，其過程是先在PCR儀中進行擴增，對DNA納米球進行定量，最后將DNA納米球載入芯片中并通過一定方式將DNB固定在芯片中，該過程工藝繁瑣，需要額外增加PCR儀和DNA納米球定量設備，制備時間長，自動化程度低。

綜上所述，如何提供一種高效擴增DNA分子信號的方法，有效避免錯誤積累及降低成本，是基因測序領域亟待解決的問題之一。

發明內容

針對現有技術的不足和實際需求，本發明提供一種基于固相載體的DNA分子信號擴增及核酸測序的方法，能夠高效、低成本地對測序過程中DNA分子信號進行擴增，同時提高測序準確性。

為達上述目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種基于固相載體的DNA分子信號擴增方法，所述方法包括：

通過羧基與氨基的縮合反應，將羧基化的DNA引物固定于表面氨基化的固相載體上，加入環狀DNA文庫和擴增試劑，進行滾環擴增，所述DNA引物與所述環狀DNA文庫通過堿基互補的方式結合。

本發明中，通過羧基與氨基的縮合反應將含有羧基的DNA引物固定于表面含有氨基的固相載體上，能夠得到高效負載DNA引物的固相載體，隨后環化的文庫與DNA引物通過堿基互補的方式結合并固定在固相載體上，文庫在酶和試劑的作用下進行滾環擴增，擴增成線性的螺旋結構，可避免橋式PCR錯誤累積，同時對設備要求低，不過度依賴PCR儀等設備，易于操作，可實現自動化制備，對于基因高通量測序領域具有重要意義。

優選地，所述固相載體的材質包括玻璃、硅膠、陶瓷、塑料或金屬中的任意一種。