[發(fā)明專利]一種用于檢測二尖梅奇酵母的引物組和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210081426.9
• 申請日: 2022-01-24
• 公開（公告）號: CN114250317B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅璋;劉厚孚;徐曉麗;丁子元;宋昀鵬;張連英
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發(fā)明屬于病原菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種用于檢測二尖梅奇酵母的引物組和試劑盒。所述引物組包括上游檢測引物和下游檢測引物；所述上游檢測引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游檢測引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明所述含有檢測引物的試劑盒具有靈敏度高、特異性強、檢測準(zhǔn)確度高的優(yōu)點，能夠有效檢出二尖梅奇酵母，方法簡便，與二尖梅奇酵母相鄰物種無交叉反應(yīng)，也與其他常見水產(chǎn)動物病原菌無交叉反應(yīng)，對于水產(chǎn)動物的疾病防控具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病原菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測二尖梅奇酵母的引物組和試劑盒。

背景技術(shù)

二尖梅奇酵母是一種致病性酵母菌，能引起中華絨螯蟹、羅氏沼蝦、大鱗大馬哈魚等多種水產(chǎn)動物病害。目前，以引起中華絨螯蟹病害尤為嚴(yán)重。患病蟹的主要癥狀為反應(yīng)遲鈍、圍心腔內(nèi)可見大量白色乳狀液體，養(yǎng)殖戶稱其為“牛奶病”。該病引起中華絨螯蟹大量死亡，嚴(yán)重時發(fā)病率可達(dá)90％，死亡率超過50％，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前，對該病尚無有效的治療措施。

開展早期檢測，選擇不攜帶二尖梅奇酵母的中華絨螯蟹進(jìn)行養(yǎng)殖是預(yù)防該疾病的有效辦法。但目前檢測方法還不完善，主要還是依靠微生物培養(yǎng)的方法進(jìn)行檢測，該方法耗時長，通常需要3天以上。在現(xiàn)有技術(shù)中，中國專利202011134597.0公開了一種二尖梅奇酵母的PCR檢測方法，在靈敏度方面，該方法檢測二尖梅奇酵母的最低限度為8.62×10個/μL；在特異性方面，檢測發(fā)現(xiàn)與羅伊氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、納豆芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、惡臭假單胞菌、釀酒酵母、近平滑假絲酵母菌、季也蒙畢赤酵母、生絲畢赤酵母、長孢洛德酵母、芽枝狀枝孢霉、木賊鐮刀菌均無特異性反應(yīng)。

評價PCR檢測方法的優(yōu)劣，靈敏度和特異性是主要指標(biāo)。靈敏度越高、特異性越強，表明效果越好。現(xiàn)有技術(shù)中建立的PCR檢測方法，在靈敏度方面，最低檢測限度(靈敏度)還有提升的空間。在特異性方面，雖然發(fā)現(xiàn)與較多二尖梅奇酵母的鄰近種都無交叉反應(yīng)，但根據(jù)報道，其他病原，例如溶藻弧菌、哈維氏弧菌(黃增榮.三疣梭子蟹(Portunustritubercularus)“牛奶病”病原的鑒定及其組織病理學(xué)研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2006.)，也能引起蟹類“牛奶病”，現(xiàn)有技術(shù)中建立的方法沒有測定是否與這些病原存在交叉反應(yīng)。此外，河蟹主要生活在水中，會經(jīng)常受到水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原的侵襲，現(xiàn)有技術(shù)中建立的方法也沒有測定與常見水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原(如柱狀黃桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、熒光假單胞菌)是否存在交叉反應(yīng)。因此，該方法還可以被進(jìn)一步的改進(jìn)和提升。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測二尖梅奇酵母的引物組和試劑盒，所述試劑盒具有靈敏度高、特異性強、檢測準(zhǔn)確度高的優(yōu)點，能夠有效檢測出二尖梅奇酵母，方法簡便，與二尖梅奇酵母相鄰物種無交叉反應(yīng)，也與其他常見水產(chǎn)動物病原菌無交叉反應(yīng)，對于水產(chǎn)動物的疾病防控具有重要意義。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種用于檢測二尖梅奇酵母的引物組，包括上游檢測引物和下游檢測引物；所述上游檢測引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游檢測引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

上游檢測引物(SEQ ID NO:1)：5’-ATGAACCCTCGTCCCAACT-3’；

下游檢測引物(SEQ ID NO:2)：5’-GATAGCCTTGCCATTACTTCC-3’。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測二尖梅奇酵母的試劑盒，包括上、下游檢測引物和檢測試劑。

進(jìn)一步地，檢測試劑包括2×TaqMasterMix和無菌水。

進(jìn)一步地，引物組中上游檢測引物和下游檢測引物的使用濃度獨立為8～12mM。