[發明專利]一種核酸適配體及其在食管癌檢測中的應用

有效

• 申請號: 202210081254.5
• 申請日: 2022-01-24
• 公開（公告）號: CN114410638B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 袁寶銀;張陽陽;王兆亭;陳新煥;趙繼敏;劉康棟
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;G01N33/574;G01N33/58
• 代理公司: 鄭州銘科知識產權代理事務所(普通合伙) 41209
• 代理人: 宋文龍

本發明公開了一種核酸適配體及其在食管癌檢測中的應用，核酸適配體，為一段長度為40bp的核苷酸序列，具體如下：A2序列：5’?CACCACGCGAATGCTATCGGGGCTAAGTATCAAAATGAGC?3’，應用于腫瘤檢測，腫瘤為食管癌相關癌癥細胞所致腫瘤，食管癌相關癌癥細胞為KYSE410細胞。本發明基于Cell?SELEX技術，篩選獲得了一條可與食管癌活細胞高特異性、高親和力結合的核酸適配體，基于本發明及進一步的相關分子探針的深入開發，可為食管癌的臨床診斷與治療奠定一定技術基礎。

技術領域

本發明屬于癌癥的生物醫學診治技術領域，具體涉及一種核酸適配體及其在食管癌檢測中的應用。

背景技術

食管癌屬于一種世界范圍內高發的高侵襲性腫瘤，每年確診人數超50萬例，是世界上最致命的癌癥之一。臨床中，食管癌有食管鱗癌和食管腺癌兩種組織分型，由于食管癌早期病癥不明顯且易在早期發生全身擴散，所以患者一般確診時即為晚期，且半數以上患者在確診時已發生轉移。由于其預后較差，確診后食管癌患者的5年生存率只有30%左右。因此，食管癌的早期診斷和及早發現對于控制腫瘤發展具有十分重要的生命意義。食管癌作為一種高發癌癥，臨床中主要通過相關病理切片方式進行確診，但這種診斷方式多屬于發病后的“事后診斷”。因此，從基因工程技術角度而言，如能開發相關診斷位點及治療靶點，可為該病的及時預防和治療奠定一定的技術基礎。

生物學研究中，核酸適配體是一段具有與靶標特異性結合功能的單鏈DNA或RNA，因其結構簡單、體積小、易于合成、修飾可控且化學穩定性好，尤其是適配體不能被免疫系統直接識別所以幾乎無免疫原性，對人體無毒性，加上其易于穿透組織屏障并易于被靶細胞內化，且易于與各種材料偶聯，因此在腫瘤成像、診斷治療等方面有廣泛的應用前景。例如，通過將適配體與熒光團、放射性同位素等材料偶聯后，可用于特定類型細胞的富集與成像，從而用于提示腫瘤類型和病變程度等信息。為此，針對食管癌，我們提出一種核酸適配體及其在食管癌檢測中的應用，可為食管癌的早期診斷和靶向治療提供一種分子識別工具。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供一種核酸適配體及其在食管癌檢測中的應用，篩選獲得了一條可與食管癌活細胞高特異性、高親和力結合的核酸適配體，為食管癌的早期診斷和治療奠定一定的技術基礎，可以有效解決背景技術中的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種核酸適配體，為一段長度為40bp的核苷酸序列，具體如下：

A2序列（SEQ?ID）：

5’-CACCACGCGAATGCTATCGGGGCTAAGTATCAAAATGAGC-3’。

一種核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟：

步驟一?文庫的構建及相關引物設計

篩選所用文庫為單鏈DNA文庫，每條單鏈DNA總長度為80nt，中間為40nt的隨機序列，5’端與3’端各有20nt的引物序列，每條DNA單鏈可表示為：

5’-AGAAGGAAGGAGAGCGACAC-40nt-TATCAGTGGTCGGTCGTCAT-3’；

文庫制備過程中，所有DNA單鏈正向引物的5’端均帶有FAM染料，以便后續使用流式細胞儀測定結合情況，可表示為：

5’-FAM-AGAAGGAAGGAGAGCGACAC-3’；

所有DNA單鏈反向引物的5’端均帶有生物素標記，以便于通過鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微珠分離正義鏈與反義鏈，從而用于后續篩選，可表示為：

5’-Biotin-ATGACGACCGACCACTGATA-3’；

文庫構建及引物合成均由生工生物技術有限公司(中國上海)完成和提供；