[發明專利]適用于弗氏鏈霉菌的透明顫菌血紅蛋白表達框及其應用

在審

• 申請號: 202210080475.0
• 申請日: 2022-01-24
• 公開（公告）號: CN114703201A
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 陳守文;金輝;石姣;魏子涵;蔡冬波;羅淦;邱湘琪;樓麗君;李俊輝
• 申請（專利權）人: 綠康生化股份有限公司
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/195;C12N15/76;C12N1/21;C12R1/54
• 代理公司: 福州鼎新知識產權代理有限公司 35263
• 代理人: 李向楠;楊慧娟

本發明屬于生物技術與發酵工程領域，提供了適用于弗氏鏈霉菌的透明顫菌血紅蛋白表達框及其應用，本發明通過將透明顫菌血紅蛋白基因vgbS與弗氏鏈霉菌中碳酸酐酶CynT的信號肽SPCynT、鏈霉菌組成型強啟動子PkasO*和弗氏鏈霉菌終止子Taph相連，組成VHb蛋白表達框PkasO*?SPCynT?vgbS?Taph，所述表達框的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。本發明的VHb蛋白表達框P_kasO*?SP_CynT?vgbS?T_aph具有更高效的表達VHb的能力，將其應用于弗氏鏈霉菌中，VHb的表達效果更好，弗氏鏈霉菌的發酵產物產量更高，新霉素的產量至少提高了14.9%。

技術領域

本發明屬于生物技術與發酵工程領域，具體涉及適用于弗氏鏈霉菌的透明顫菌血紅蛋白表達框及其應用。

背景技術

鏈霉菌在分類學上屬于原核生物界放線菌目鏈霉菌科，具有多樣化的基因組和極高的GC（70～76%）含量。自然界約70％的抗生素是由鏈霉菌及其近緣放線菌產生。新霉素是由弗氏鏈霉菌產生的氨基糖苷類抗生素，能夠干擾蛋白質合成，是國內外最為常用的獸用抗生素之一。其主要成分為新霉素B和C，以及少量新霉素A。新霉素B相對其他組分而言活性強、毒性低，是發酵過程中需要監測的主要組分。

表達載體pSET152是大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒，其中具有接合轉移的oriT功能區域、鏈霉菌篩選標記-安普霉素抗性基因acc3(IV)、整合酶基因int(φC31)、鏈霉菌溫和噬菌體φC31的attP位點。因此，pSET152可利用簡便高效的屬間接合轉移法導入鏈霉菌，并可通過特異性重組整合在鏈霉菌染色體的attB位點上，隨著宿主染色體的復制而復制。

透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）是目前為止研究最為透徹的原核生物血紅蛋白，來源于一種革蘭氏陰性菌—透明顫菌。自然狀態下的VHb以同型二聚體形式存在，兩個亞基由146個氨基酸殘基形成6個α-螺旋（A，B，E，F，G，H），相對分子量為15.8kDa，且各含有一分子b型血紅素。低氧條件下，VHb可以與氧結合，發生構象變化，又能夠與氧解離，將氧傳遞給呼吸鏈，調節呼吸鏈末端氧化酶的活性。目前，VHb已在多種宿主細胞（大腸桿菌、假單胞菌、煙草、水稻、斑馬魚等）中成功表達，用于改善動植物細胞特性、改善細菌在高耗氧或氧氣受限的高密度發酵中的生長情況。VHb的編碼基因為：vgb基因。依據弗氏鏈霉菌密碼子偏好性優化vgb基因得到：vgbS基因。

陳文青等基于質粒pWQ2005中的硫鏈絲菌素誘導啟動子PtipA啟動vgb的表達，利用接合轉移法將vgb基因整合到泰樂菌素的生產菌株弗氏鏈霉菌中，但由于PtipA啟動子受到硫鏈絲菌素誘導，而在發酵過程中添加硫鏈絲菌素對菌體生長不利。并且，現有技術中均是單獨將血紅蛋白基因—vgb基因在鏈霉菌中進行強化表達，其表達效果以及促菌體生長和發酵產物合成的效果有限。如何構建適用于弗氏鏈霉菌的高效表達的VHb表達框一直亟待研究。

信號肽（又稱“穿膜肽”）是蛋白質N-末端一段編碼長度為5-30的疏水性氨基酸序列，用于引導新合成蛋白質向通路轉移的短肽鏈。信號肽存在于分泌蛋白、跨膜蛋白和真核生物細胞器內的蛋白中。信號肽酶有三種：SPaseI、SPaseII和SPaseIII。目前尚無法根據前人結果選擇合適的信號肽來構建適用于弗氏鏈霉菌的透明顫菌血紅蛋白表達框進行弗式鏈霉菌中透明顫菌血紅蛋白的高效表達及基于透明顫菌血紅蛋白高效表達的代謝產物的高效合成。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種適用于弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）的透明顫菌血紅蛋白表達框。

適用于弗氏鏈霉菌的透明顫菌血紅蛋白表達框，所述表達框的核苷酸序列為SEQID NO.1所示。