[發明專利]溫敏雄性不育基因HSP60-3B及其應用和育性恢復的方法

有效

• 申請號: 202210080137.7
• 申請日: 2022-01-24
• 公開（公告）號: CN114480418B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 梁婉琪;林森;劉澤;張大兵;袁政;陳明姣
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

1.一種水稻溫敏雄性不育基因HSP60-3B的應用，其特征在于，所述溫敏雄性不育基因HSP60-3B編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No.?1所示，所述的應用具體是，使常規水稻品種中如SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列突變為SEQ?ID?No.9，進而獲得水稻雄性不育株系；所述常規水稻品種為粳稻品種9522；

或，采用CRISPR/Cas9系統定點敲除HSP60-3B基因，抑制編碼如SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表達，獲得水稻溫敏雄性不育株系；所述CRISPR/Cas9系統定點敲除的方法包括如下步驟：

a)?合成單核苷酸序列，引物如SEQ?ID?No.3和?SEQ?ID?No.4所示；

b)?通過退火反應使合成的單核苷酸序列形成二聚體結構，與載體片段進行連接反應，構建含有水稻HSP60-3B基因靶序列的HSP60-3B-sgRNA-Cas9質粒；所述靶序列如SEQ?IDNo.13所示；

c）用含HSP60-3B-sgRNA-Cas9質粒的根癌農桿菌侵染水稻品種；

d)?通過將HSP60-3B基因的特異性引物擴增基因組片段進行測序，篩選突變植株。

2.一種水稻溫敏雄性不育株系的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：選擇常規水稻品種，處理，培育，即得所述水稻溫敏雄性不育株系，所述處理為，使常規水稻品種中如SEQID?No.1所示氨基酸序列突變為SEQ?ID?No.9，進而獲得水稻雄性不育株系；所述常規水稻品種為粳稻品種9522；

或，采用CRISPR/Cas9系統定點敲除HSP60-3B基因，抑制編碼如SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表達，獲得水稻溫敏雄性不育株系；所述CRISPR/Cas9系統定點敲除的方法包括如下步驟：

a)?合成單核苷酸序列，引物如SEQ?ID?No.3和?SEQ?ID?No.4所示；

b)?通過退火反應使合成的單核苷酸序列形成二聚體結構，與載體片段進行連接反應，構建含有水稻HSP60-3B基因靶序列的HSP60-3B-sgRNA-Cas9質粒；所述靶序列如SEQ?IDNo.13所示；

c）用含HSP60-3B-sgRNA-Cas9質粒的根癌農桿菌侵染水稻品種；

d)?通過將HSP60-3B基因的特異性引物擴增基因組片段進行測序，篩選突變植株。

3.一種如權利要求2所述的方法獲得的水稻溫敏雄性不育株系在水稻制種中的用途，其特征在于，所述用途為：在平均溫度32℃至34℃條件下，以水稻HSP60-3B不育株系作為母本，進行雜交育種；或，在平均溫度22℃條件下，以水稻HSP60-3B株系進行自交制種。

4.一種恢復水稻溫敏雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，其特征在于，包括如下步驟：采用常規遺傳手段將所述HSP60-3B基因轉入如權利要求2所述方法獲得的水稻雄性不育株系中，進而使得突變體恢復野生型表型；所述HSP60-3B基因編碼的氨基酸序列如SEQID?No.?1所示。

5.如權利要求4所述的恢復水稻溫敏雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，其特征在于，包括如下步驟：將含HSP60-3B互補構建載體的根癌農桿菌EHA105轉入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中HSP60-3B互補構建載體含有序列如SEQ?ID?No.?5?所示的核苷酸。

6.如權利要求5所述的恢復水稻溫敏雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，其特征在于，所述方法具體包括如下步驟：

(a)從水稻9522基因組中用堿基序列如SEQ?ID?No.6和SEQ?ID?No.7所示的引物擴增出HSP60-3B基因的基因組序列片段；

(b)提供權利要求5中含HSP60-3B互補構建載體的根癌農桿菌EHA105；

(c)將根據權利要求2所述方法獲得的水稻雄性不育株系的細胞、組織或器官與步驟(b)中的農桿菌接觸，從而使編碼如SEQ?ID?No.?1所示氨基酸的核苷酸轉入水稻細胞，并且整合到水稻細胞的染色體上；

(d)選擇轉入所述核苷酸的水稻細胞、組織或器官，再生，獲得恢復育性的水稻植株。