[發明專利]一種馬尾松高產脂功能SNP標記的篩選方法及其應用

有效

• 申請號: 202210079030.0
• 申請日: 2022-01-24
• 公開（公告）號: CN114255822B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 白青松;何波祥;汪迎利;連輝明;陳杰連
• 申請（專利權）人: 廣東省林業科學研究院
• 主分類號: G16B20/20
• 分類號: G16B20/20;G16B20/30;G16B30/10;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 劉瑜

1.一種馬尾松高產脂功能SNP標記的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)依據表型選擇材料

采集m個無性系馬尾松的松脂，每個無性系馬尾松選擇n個植株，然后根據產脂力計算公式分別計算其產脂力，并計算每個植株產脂力的平均值；接著分別以每個無性系馬尾松的產脂力最大的植株作為高產脂力植株，以產脂力最小的植株作為低產脂力植株，以產脂力等于或接近產脂力平均值的植株作為中產脂力植株；再分別采集每個無性系馬尾松的高、中、低產脂力植株的次生木質部組織材料；其中，m≥3，n≥3；產脂力RYC的計算公式如下：

式中：Wt表示松脂總重量；D表示每棵樹切割樹脂的次數；Wd表示割面寬度；C表示樹皮被切割處的樹干周長；

(2)基于多組學數據聯合分析篩選候選基因

對步驟(1)中采集的每個無性系馬尾松的高、中、低產脂力植株的組織材料分別進行轉錄組和代謝組測序，同時將所有組織材料混合后進行PacBio全長轉錄組測序；然后利用多組學數據進行差異表達分析，并根據轉錄組與代謝組聯合分析初步篩選得到候選基因；

(3)qRT-PCR驗證基因表達量

分別提取每個無性系馬尾松的高、中、低產脂力植株的組織材料的RNA，并將其反轉錄為cDNA，然后采用qRT-PCR方法驗證步驟(2)中篩選得到的候選基因的表達量，選擇差異表達的基因用于SNP位點開發；

(4)開發SNP位點

分別提取每個無性系馬尾松的高、中、低產脂力植株的組織材料的DNA，然后進行PCR全長擴增，再直接進行高、中、低產脂力植株的序列相互比較開發SNP分子標記，篩選得到SNP位點；

(5)開發產脂力性狀功能SNP位點

根據步驟(4)中篩選得到的SNP位點，對每個無性系馬尾松的高、中、低產脂力植株的基因型進行關聯分析，得到與產脂力性狀顯著相關的SNP標記，進而篩選得到馬尾松高產脂功能SNP標記。

2.根據權利要求1所述的馬尾松高產脂功能SNP標記的篩選方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的m的取值范圍為：m≥20；

步驟(1)中所述的n的取值范圍為：n≥5；

步驟(2)中所述的候選基因為選擇3個以上的候選基因。

3.根據權利要求2所述的馬尾松高產脂功能SNP標記的篩選方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的m的取值范圍為：m≥50；

步驟(1)中所述的n的取值范圍為：5≤n≤20；

步驟(2)中所述的候選基因為選擇5個以上的候選基因。

4.根據權利要求3所述的馬尾松高產脂功能SNP標記的篩選方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的候選基因為MG7、MG25、MG26、MG27、MG36基因，其核苷酸序列如SEQ?IDNO.1～5所示。

5.根據權利要求1所述的馬尾松高產脂功能SNP標記的篩選方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的松脂的采集時間為每年的7～9月；

步驟(1)中所述的組織材料的采集部位高度與割脂部位相同，采集時間以中午12點～1點晴朗天氣；

步驟(1)中所述的中產脂力植株選擇產脂力為中位數對應的植株作為中產脂力植株；

步驟(1)中所述的無性系馬尾松的樹齡10年生以上或胸徑達到16cm以上的無性系馬尾松；

步驟(1)中所述的組織材料包括次生木質部、成熟針葉、成熟枝條或未成熟枝條。

6.根據權利要求1所述的馬尾松高產脂功能SNP標記的篩選方法，其特征在于：

步驟(3)中所述的qRT-PCR方法中所用的引物序列如SEQ?ID?NO.19～28所示；

步驟(3)中所述的qRT-PCR方法中的擴增反應程序為：變性溫度95℃持續10秒，退火溫度57℃～62℃持續30秒，延伸溫度72℃持續20秒；

步驟(4)中所述的PCR全長擴增所用的引物序列如SEQ?ID?NO.29～38所示；

步驟(4)中所述的PCR全長擴增的反應程序為：預變性溫度94℃持續5分鐘，變性溫度94℃持續1分鐘，退火溫度55℃～63℃持續30秒，延伸溫度72℃持續時間1～3分鐘。