[發明專利]檢測鮑皰疹病毒的引物組及其在構建病毒檢測方法和試劑盒中的應用

在審

• 申請號: 202210076336.0
• 申請日: 2022-01-24
• 公開（公告）號: CN114085931A
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發明（設計）人: 白昌明;谷莉;辛魯生;王崇明
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 山東三邦知識產權代理事務所(普通合伙) 37308
• 代理人: 張立得;肖太升

本發明公開了檢測鮑皰疹病毒的引物組及其在構建病毒檢測方法和試劑盒中的應用，屬于生物檢測技術領域。本發明所述檢測鮑皰疹病毒的引物組是根據SEQ ID No:1所示的核酸序列設計的，在此基礎上，可將本發明所述的引物組應用在原位LAMP檢測方法中以實現鮑皰疹病毒的快速檢測，同時，利用上述原位LAMP檢測方法還可以快速完成石蠟組織切片中HaHV?1的檢測，并實現對病毒在組織中的精確定位，以明確HaHV?1在鮑組織器官中的分布規律。由于本發明所述的引物組靈敏度高、特異性好，還可將其制備成試劑盒，以實現鮑皰疹病毒的快速和簡便檢測，應用前景廣闊。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及檢測鮑皰疹病毒的引物組及其在構建病毒檢測方法和試劑盒中的應用。

背景技術

鮑皰疹病毒1（Haliotid herpesvirus 1，HaHV-1）是皰疹病毒目（Herpesvirales），軟體動物皰疹病毒科（Malacoherpesviridae），鮑皰疹病毒屬（Aurivirus）下的唯一種，與感染雙殼貝類的另一種軟體動物皰疹病毒——牡蠣皰疹病毒（Ostreid herpesvirus 1，OsHV-1）的親緣關系最近。感染HaHV-1病毒的病鮑主要表現為攝食量減少、活力下降、粘液分泌增多和脫板等非典型癥狀，出現癥狀3~7d后即發生大規模死亡。病鮑表現的主要病理特征是腹足神經節、中樞神經與外周神經組織炎癥和細胞浸潤。滲出的細胞中有大量被病毒感染的血淋巴細胞；感染后期的外套膜、肝胰腺等器官的結締組織也被病毒侵染。

HaHV-1感染的臨床癥狀和病理特征僅能作為HaHV-1感染診斷的輔助手段，其確診需要使用分子生物學技術。例如，Corbeil等基于TaqMan? qPCR技術，針對病毒開放閱讀框（ORF）48設計特異性引物，建立了HaHV-1特異性的實時定量PCR檢測方法（Diseases ofAquatic Organisms, 2010, 92(1): 1-10.）。Mohammad等基于地高辛(DIG)標記技術，針對ORF66設計探針，建立了HaHV-1的原位雜交檢測技術（Proceedings of the First FRDCAustralasian Scientific Conference on Aquatic Animal Health, Carins,Australia, 2011.）。Gao等基于重組酶聚合酶擴增（RPA）技術，針對ORF38設計引物和探針，建立了HaHV-1的qRPA快速定量檢測技術（J Virol Methods, 2018, 251:92-98.）。Corbeil等的研究結果顯示，綠唇鮑和黑唇鮑雜交種人工感染HaHV-1后36小時，使用實時定量PCR可以從病鮑神經組織檢測到病毒DNA，而使用原位雜交方法在攻毒感染48小時后，可以在鮑腹足神經節檢測到HaHV-1信號的存在（Virus Research, 2012, 165(2): 207-213.）。上述檢測方法存在靈敏度低，檢測時間長，以及假陰性多發等問題。為此，尋求一種靈敏度高、特異性好、檢測時間短的方法，具有廣闊的應用前景。

發明內容

為實現鮑皰疹病毒的快速有效檢測，本發明根據SEQ ID No:1的核酸序列設計了三套引物組，引物組序列如下所示：

第一套：

F3：5'-GACGAAGAGCTCGCGAAAT-3'；

B3：5'-CTTTGGCATGTCGCCCTT-3'；

FIP：5'-CCTTCCATGGGTTCCGGGTTTTTCTACGACGGGGAAGCTAAC-3'；

BIP：5'-GATGTGTACGACCCCGACACGGTCCCAGCGCTCTCTGAA-3'；

F2：5'-TCTACGACGGGGAAGCTAAC-3'；

F1c：5'-CCTTCCATGGGTTCCGGGTTTT-3'；

B2：5'-GTCCCAGCGCTCTCTGAA-3'；

B1c：5'-GATGTGTACGACCCCGACACG-3'。