[發明專利]一種空腔工程化技術提高酶熱穩定性和催化活性的方法

在審

• 申請號: 202210059055.4
• 申請日: 2022-01-18
• 公開（公告）號: CN114330025A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 夏小樂;張澤華;龍夢飛;高玲;王穎妤;鄭楠
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G06F30/20
• 分類號: G06F30/20;G16B15/20;C12N9/02;C12N9/10;C12N9/20;G06F119/02
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種空腔工程化技術提高酶熱穩定性和催化活性的方法，屬于生物信息學、計算化學、生物工程、生物物理及蛋白質工程等領域。本發明首先以分子動力學模擬(MD)蛋白運動，通過聚類分析挑選出代表性構象后通過AQUA?DUCT分析模擬軌跡并篩選出蛋白內部關鍵空腔，再篩選出組成關鍵內部空腔附近的氨基酸殘基同時排除結合活性位點一定范圍的氨基酸殘基，再結合多尺度自由能計算軟件以能量為指標對上述殘基位點執行飽和突變，經篩選獲得潛在的陽性突變體。利用本發明方法得到的陽性突變率最高達到90％，酶的熱穩定性和催化活性均得到增強，具有非常高的應用潛力。

技術領域

本發明屬于生物信息學、計算化學、生物工程、生物物理及蛋白質工程等領域，具體涉及一種空腔介導的工程化技術提高酶熱穩定性和催化活性的方法。

背景技術

酶(Enzyme)通常是指由活細胞產生的具有高度特異性和催化作用的蛋白質或RNA，易受溫度、pH等眾多外界環境因素的影響。根據催化的反應類型的不同，可分為氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶和連接酶等六大類。因酶具有良好的催化功能，在食品、醫藥、油脂生產和加工以及化妝品等工業領域均得到了廣泛應用。

然而，實際工業生產中，由于較嚴苛復雜的工業條件，酶經常在溫度、壓力和溶液等各種外部干擾下發生結構轉變，從而影響其穩定性和催化活性。因此，增強酶的穩定性和活性是工業生產中的一條必經之路。但是，在酶進化的過程中，經常伴隨著熱穩定性和催化活性間的折中，最后導致兩者的提高只能取其一。例如，Shi等對NTU 03脂肪酶蓋子區域的第189號天冬氨酸殘基進行突變后導致該酶活性升高，但是熱穩定性下降(Shih T W,Pan TM.Substitution of Asp189 residue alters the activity and thermostability ofGeobacillus sp.NTU 03lipase[J].Biotechnology Letters,2011,33(9):1841-1846.)。但也有少數關于酶穩定性與催化活性同時得到改善的相關報道。例如，Wong等人通過同源建模和分子對接的方法對來源于Trigonopsis variabilis的D-氨基酸氧化酶進行改造，使突變體Phe54Tyr的熱穩定性以及活性同時提高(Kamal M Z,Ahmad S,Molugu T R,etal.In vitro evolved non-aggregating and thermostable lipase:structural andthermodynamic investigation[J].J Mol Biol,2011,413(3):726-741.)。盡管已有部分研究披露了同時提高穩定性和活性的方法，但并沒有系統性的研究其機制問題，盲目性較大，因此需要開發一種提高酶特性的通用方法。

對于氨基酸呈現緊密排列的天然蛋白，其獨特的原子堆積對蛋白質的功能、穩定性、活性和選擇性等有重要影響，研究者們稱之為“cavity”，即空腔。通常根據功能可將其分為3類：域間空腔、域內空腔、亞基間空腔。其中，域內空腔已被廣泛認為是對天然蛋白的熱穩定性和催化活性最大的貢獻者。它的大小和空間排列對蛋白的穩定性和催化活性有巨大影響。因此如何篩選蛋白中對穩定性和催化活性有重要作用的關鍵空腔至關重要。關于利用空腔來提高酶的穩定性和催化活性，目前主要的做法是通過氨基酸殘基突變來創造空腔或減小空腔的體積，未有針對空腔進行一個系統性的篩選。

分子動力學(Molecular dynamics,MD)模擬是指基于牛頓經典力學發展的計算方法來模擬蛋白體系中所有原子的運動軌跡，它增加了我們對蛋白質調控元件如門以及環的構象變化認識。它提高了我們對溶劑在蛋白質折疊和穩定性，在塑造酶的活性和選擇性，或在藥物設計中的作用的理解。目前，分子動力學模擬的應用方法主要是在恒溫恒壓條件下對蛋白以及小分子等體系進行運動軌跡的模擬并分析。