[發明專利]永生化豬骨髓巨噬細胞、其構建方法及應用

在審

• 申請號: 202210051308.3
• 申請日: 2022-01-17
• 公開（公告）號: CN114292873A
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 張大鶴;滕小锘;王俊肖;徐龍飛
• 申請（專利權）人: 蘇州沃美生物有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/37;C12N15/12;C12R1/91
• 代理公司: 南京利豐知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32256
• 代理人: 趙世發;王鋒

1.一種永生化豬骨髓巨噬細胞的構建方法，其特征在于，包括：以包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第一重組質粒轉染豬骨髓巨噬細胞，再培養轉染后的細胞，并分離出細胞單克隆。

2.根據權利要求1所述的永生化豬骨髓巨噬細胞的構建方法，其特征在于，所述第一重組質粒的構建方法包括：

通過PCR將BglII和BCLI位點加入SV40TAg的核苷酸序列中，獲得重組SV40TAg基因；

使用BglII和BCLI位點將重組SV40TAg基因克隆入pIED-Neo質粒，從而生成所述第一重組質粒，定義為pIED-Neo-SV40TAg質粒。

3.根據權利要求1所述的永生化豬骨髓巨噬細胞的構建方法，其特征在于，具體包括：

選取15日齡健康仔豬的腿骨，使用完全培養基沖洗骨髓腔，獲得骨髓細胞，

將所述骨髓細胞以GM-CSF誘導培養液誘導分化成為豬骨髓巨噬細胞；

其中，所述完全培養基含有10V/V％的胎牛血清；

所述GM-CSF誘導培養液包含1wt％primocin抗生素、10wt％FBS和100ng/mLGM-CSF，余量為1640培養基。

4.根據權利要求3所述的永生化豬骨髓巨噬細胞的構建方法，其特征在于，還包括：將所述豬骨髓巨噬細胞以完全培養基重懸，35～38℃培養50～80min，取培養后未貼壁的細胞轉入新的完全培養基中培養，從而實現所述豬骨髓巨噬細胞的擴增。

5.一種永生化豬骨髓巨噬細胞，其特征在于，它是由權利要求1-4中任一項所述的方法構建。

6.一種永生化豬骨髓巨噬細胞的改造方法，其特征在于，包括：以包含SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第二重組質粒和/或包含SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第三重組質粒轉染權利要求5所述的永生化豬骨髓巨噬細胞，并篩選出其中的陽性細胞株，獲得對病毒敏感的永生化豬骨髓巨噬細胞。

7.根據權利要求6所述的永生化豬骨髓巨噬細胞的改造方法，其特征在于，具體包括：

(1)以所述第二重組質粒轉染所述永生化豬骨髓巨噬細胞，之后采用400～1200μg/ml新霉素處理經轉染后的永生化豬骨髓巨噬細胞系，處理一周后，篩選出其中的陽性細胞克隆，并挑選單克隆細胞株，獲得轉染CD163-CD169-CD51成功的永生化豬骨髓巨噬細胞系；

(2)以所述第三重組質粒轉染所述轉染CD163-CD169-CD51成功的永生化豬骨髓巨噬細胞系，之后采用0.5～5μg/ml嘌呤霉素處理經再次轉染后的永生化豬骨髓巨噬細胞系，處理一周后，篩選出其中的陽性細胞克隆，并挑選單克隆細胞株，獲得轉染Ibal-KT022-Cd172a成功的永生化豬骨髓巨噬細胞系，即所述對病毒敏感的永生化豬骨髓巨噬細胞。

8.根據權利要求6或7所述的永生化豬骨髓巨噬細胞的改造方法，其特征在于，所述第二重組質粒的構建方法包括：通過PCR將SEQ ID NO.2所示核苷酸序列克隆入第一重組質粒，獲得所述第二重組質粒，定義為pIED-Neo-CD163-CD169-CD151質粒。

9.根據權利要求6或7所述的永生化豬骨髓巨噬細胞的改造方法，其特征在于：所述第三重組質粒的構建方法包括：通過PCR將SEQ ID NO.3所示核苷酸序列克隆入第一重組質粒，獲得所述第三重組質粒，定義為pIED-Ibal-KT022-Cd172a質粒。

10.根據權利要求6或7所述的永生化豬骨髓巨噬細胞的改造方法，其特征在于，還包括：以無血清懸浮培養基對所述對病毒敏感的永生化豬骨髓巨噬細胞進行懸浮馴化；

其中，所述無血清培養基包含無機鹽、維生素、氨基酸、糖、微量元素、黃原膠、白介素-2、表皮生長因子、胰島素、酵母水解物、大豆水解物。