[發(fā)明專利]基于脂肪酶大腸桿菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210051005.1
• 申請日: 2022-01-17
• 公開（公告）號: CN114317623B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 信豐學(xué);姜岷;陳泓羽;陸家聲;蔣羽佳;姜萬奎;章文明
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P7/62;C12P39/00
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 尹妍;徐蓓

本發(fā)明涉及基于脂肪酶大腸桿菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法，在產(chǎn)丁酸丁酯菌株發(fā)酵階段，加入脂肪酶表面展示大腸桿菌的發(fā)酵液或同體積脂肪酶表面展示大腸桿菌發(fā)酵液離心后收集所得菌體沉淀；所述脂肪酶表面展示大腸桿菌構(gòu)建方式為：將脂肪酶lipA的編碼基因和錨定蛋白estA的編碼基因克隆到表達(dá)載體上，構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，即所述脂肪酶表面展示大腸桿菌。本發(fā)明的合成方法解決了解決丁酸丁酯生物合成方法對外源脂肪酶依賴造成成本過高的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種基于脂肪酶大腸桿菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法。

背景技術(shù)

丁酸丁酯是一種應(yīng)用廣泛的短鏈脂肪酸酯，作為溶劑廣泛用于有機(jī)合成過程；因具有梨、菠蘿樣香氣，是調(diào)制食品、飲料及日用化妝品、香精等不可缺少的原料，也是我國GB2760-86?規(guī)定允許使用的食用香料。此外，丁酸丁酯在低溫下具有與航空柴油相似的理化性質(zhì)，可直接用作航空燃料，是一種更高附加值的燃料添加劑。丁酸丁酯天然存在于菠蘿、香蕉和草莓等水果中，然而含量非常低。

傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝以丁酸和丁醇為原料、濃硫酸為催化劑，通過酯化反應(yīng)合成，該工藝雖然技術(shù)成熟、產(chǎn)品收率高，但存在副反應(yīng)多、設(shè)備腐蝕嚴(yán)重、“三廢”排放量大等弊端。因此，迫切需要開發(fā)新型生產(chǎn)工藝，實現(xiàn)丁酸丁酯的高效合成。生物發(fā)酵法合成丁酸丁酯能以可再生的生物質(zhì)為原料，具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品純度高、過程綠色環(huán)保等優(yōu)勢。目前，生物發(fā)酵法合成丁酸丁酯基于合成類型主要分為四類：（1）一步發(fā)酵法直接合成丁酸丁酯，即以單糖為底物直接發(fā)酵合成丁酸丁酯；（2）基于溶劑梭菌ABE發(fā)酵合成丁酸丁酯，即以單糖為底物，外源添加丁酸和脂肪酶合成丁酸丁酯；（3）基于產(chǎn)丁酸梭菌發(fā)酵合成丁酸丁酯，即以單糖為底物，外源添加丁醇和脂肪酶合成丁酸丁酯；（4）溶劑梭菌和產(chǎn)丁酸梭菌混菌發(fā)酵合成丁酸丁酯，即以單糖為底物，外源添加脂肪酶。利用脂肪酶催化合成丁酸丁酯，產(chǎn)品純度高，然而酶成本較高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。

生物法合成丁酸丁酯中的關(guān)鍵步驟為一個以丁酸和丁醇為底物，生成丁酸丁酯的酯化反應(yīng)，反應(yīng)中的催化劑可由脂肪酶承擔(dān)。脂肪酶又名甘油酯水解酶，可催化三酰甘油水解生成游離脂肪酸和甘油，在微環(huán)境中的水解反應(yīng)是可逆的。脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，除了對三酰甘油酯有水解活性，還可催化酯化反應(yīng)，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，氨解反應(yīng)等。脂肪酶參與的催化反應(yīng)具有不需要輔酶、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少等優(yōu)點。目前較常用的工業(yè)化脂肪酶中，有諾維信公司推出的商品固定化脂肪酶—諾維信435。諾維信435通過將來源于南極假絲酵母的脂肪酶B（CALB）吸附于丙烯酸樹脂制得，市價約為200元/克，價格昂貴，提高了生物法合成丁酸丁酯的成本。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決丁酸丁酯生物合成方法對外源脂肪酶依賴造成成本過高的問題，本發(fā)明提供了一種基于脂肪酶大腸桿菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法。

為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

基于脂肪酶大腸桿菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法，在產(chǎn)丁酸丁酯菌株發(fā)酵階段，加入脂肪酶表面展示大腸桿菌的發(fā)酵液或同體積脂肪酶表面展示大腸桿菌發(fā)酵液離心后收集所得菌體沉淀；

所述脂肪酶表面展示大腸桿菌構(gòu)建方式為：

將脂肪酶 lipA的編碼基因和錨定蛋白 estA的編碼基因克隆到表達(dá)載體上，構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，即所述脂肪酶表面展示大腸桿菌；