[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)微囊藻毒素-LR的試紙檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210050940.6
• 申請(qǐng)日: 2022-01-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114384242A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇高星;康宇亮;于艷艷;曹加佳;閆兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/558
• 分類號(hào): G01N33/558;G01N33/543;G01N33/58
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種用于檢測(cè)微囊藻毒素-LR的試紙檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.將適配體Aptamer和互補(bǔ)鏈Blocker加入TAMg緩沖液中混合搖勻得反應(yīng)液，將所述反應(yīng)液95℃加熱5min，然后逐漸冷卻至4℃，形成DNA雙鏈Probe；

所述適配體Aptamer的序列如SEQ NO.1所示，所述適配體Aptamer的一端修飾有生物素Biotin，所述互補(bǔ)鏈Blocker的序列如SEQ NO.2所示；

S2.將鏈霉親和素磁珠溶液分散在2×BW緩沖溶液中，加入所述DNA雙鏈Probe，室溫孵育1h后，磁分離收集獲得磁珠-DNA探針，以1×PBS緩沖溶液漂洗待用；

S3.用40℃的PBS沖洗磁珠-DNA探針以減少背景信號(hào)，將磁珠-DNA探針與待檢測(cè)水樣混合，恒溫孵育，然后進(jìn)行磁分離，留上清；所述恒溫孵育的溫度為36℃-38℃，所述恒溫孵育的時(shí)間為1.5-3h；

S4.將Cas12a溶液和crRNA溶液加入第一緩沖液中，37℃恒溫孵育10min后，加入第二緩沖液和所述上清，37℃孵育20min后，加入Reporter溶液，37℃孵育20min；所述第一緩沖液和所述第二緩沖液均為10×NEBuffer 2.1緩沖液；

crRNA的序列如SEQ NO.3所示；

所述信號(hào)鏈Reporter的一端為熒光素FAM，另一端為生物素Biotin；

S5.將步驟S4孵育得到的溶液用無(wú)菌水稀釋后插入檢測(cè)試紙檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷所述待測(cè)水樣中是否存在微囊藻毒素-LR。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S1中，所述反應(yīng)液中，適配體Aptamer的濃度為1v/v％，互補(bǔ)鏈Blocker的濃度為1v/v％。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S2中，鏈霉親和素磁珠溶液、2×BW緩沖溶液和DNA雙鏈Probe的體積比為1:50:50，其中，所述鏈霉親和素磁珠溶液的濃度為30mg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S3中，所述恒溫孵育的溫度為38℃，所述恒溫孵育的時(shí)間為2h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S4中，Cas12a溶液和crRNA溶液濃度為1μM，體積比為1:2。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試紙檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S4中，Cas12a溶液、crRNA溶液、第一緩沖液、第二緩沖液、上清和Reporter溶液的體積比為2:4:0.7:9.3:84:1，所述Reporter溶液的濃度為100μM。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S5中，所述稀釋的稀釋倍數(shù)為20倍。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙檢測(cè)方法，其特征在于，步驟S5中，所述檢測(cè)試紙包括C線和T線，所述C線包埋鏈霉親和素，所述T線包埋二抗。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試紙檢測(cè)方法，其特征在于，所述根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷所述待測(cè)水樣中是否存在微囊藻毒素-LR具體為：根據(jù)所述檢測(cè)試紙的T線是否顯色來(lái)檢測(cè)微囊藻毒素-LR的存在，若T線顯示為紅色，則說(shuō)明所述待測(cè)水樣中存在微囊藻毒素-LR。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的試紙檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)的檢測(cè)下限為0.001μg/L。