[發明專利]一種磁珠-DNA探針、MC-LR檢測生物傳感器及制備方法與應用

在審

• 申請號: 202210050334.4
• 申請日: 2022-01-17
• 公開（公告）號: CN114395558A
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 蘇高星;康宇亮;于艷艷;王佳莉;張文思
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/543
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于生物傳感器及環境監測領域，公開了一種磁珠?DNA探針、MC?LR檢測生物傳感器及制備方法與應用。本發明生物傳感器包括磁珠?DNA探針、Cas12a?crRNA和信號鏈Reporter。當MC?LR存在時，的DNA雙鏈Probe上的DNA雙鏈Probe中的Blocker鏈與MC?LR競爭結合Aptamer，進而釋放Blocker鏈，釋放的Blocker鏈來激活Cas12a?crRNA，Cas12a核酸酶被激活后，可非特異性切斷信號鏈Reporter鏈，產生熒光。該生物傳感器對MC?LR具有高特異性和靈敏性，并且成本低廉，可用于真實環境水樣的檢測。

技術領域

本發明屬于生物傳感器及環境監測領域，具體涉及一種磁珠-DNA探針、MC-LR檢測生物傳感器及制備方法與應用。

背景技術

隨著水體富營養化的逐步加劇，藍藻水華和赤潮的發生逐步增加。越來越多的水源受到藍藻水華的次生代謝產物-微囊藻毒素(MCs)的污染，對水體環境和人群健康構成巨大的威脅。而MC-LR是其中最普遍、最具毒性的微囊藻毒素同源物，能夠強烈抑制蛋白磷酸酶的活性，還是強烈的肝臟腫瘤促進劑。考慮到其強毒性，中國生活飲用水衛生標準(GB5749-2006)的頒布，將飲用水中微囊藻毒素含量限制為1μg/L。因此，在水環境中監測MC-LR對環境安全與人體健康至關重要。

檢測MC-LR的傳統方法包括高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜與質譜聯用(LC-MS)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、蛋白磷酸酶抑制試驗(PPIA)、以及光學和電化學傳感器。HPLC-MS雖然有較高的靈敏度和特異性，但是其需要龐大而昂貴的機器設備，這對現場檢測MC-LR造成了一定的阻礙。ELISA和PPIA雖然利用了酶的特異性，然而其需要多步驟冗長的檢測過程。電化學傳感器雖然有極靈敏的檢測效果，但是需要合適的電極材料以及適宜的電極修飾。光學傳感器操作簡單，但是也受到了靈敏度和特異性的限制。

通過查閱文獻知道，原核生物已經開發出一種成簇規則間隔短回文重復序列(CRISPR)的適應性免疫系統。過去的幾年里，CRISPR-Cas9酶經過各種重新設計，引起了基因編輯熱潮。而CRISPR-Cas12a是一種新的RNA引導的核酸酶，正在成為基因編輯最常用的工具，其對DNA識別的特異性、靈敏性和可編程性在分子診斷領域備受關注，做為一些強大診斷工具的核心，其有望解決生物傳感器在靈敏度和特異性等方面的問題。

傳統的抗原-抗體反應靈敏度、特異性均好，但是蛋白質做為探針分子容易變性，而且價格昂貴，適配體由DNA分子構成，經SELEX富集篩選，可以具有與抗原-抗體相匹敵的靈敏度，同時更易合成，穩定性更好。所以我們在生物傳感器的基礎上，結合DNA適配體的特異性、酶的特異性，構建出一種操作簡單同時高靈敏度的MC-LR檢測平臺，同時通過對信號鏈的設計，利用側向流動試紙條直接檢測MC-LR，操作簡單，省去現場檢測時機器設備帶來的不便。

發明內容

本發明要解決的技術問題是構建一種可現場檢測MC-LR的磁珠-DNA探針、包含該磁珠-DNA探針的生物傳感器，該生物傳感器具有高特異性和靈敏性，并且成本低廉，操作步驟簡便。

本發明提供了一種磁珠-DNA探針，所述磁珠-DNA探針由適配體Aptamer和其互補鏈Blocker結合得到的DNA雙鏈Probe結合在鏈霉親和素磁珠表面所構成，所述鏈霉親和素磁珠為表面偶聯有鏈霉親和素的磁珠，所述適配體Aptamer的序列如SEQ NO.1所示，所述適配體Aptamer的5’端連接生物素-Biotin，所述互補鏈Blocker的序列如SEQ NO.2所示。

進一步的，上述磁珠-DNA探針的制備方法，包括以下步驟：

a)將適配體Aptamer和互補鏈Blocker加入TAMg緩沖液中混合搖勻得反應液，將所述反應液95℃加熱5min，然后逐漸冷卻至4℃，形成DNA雙鏈Probe；所述反應液中，Aptamer的濃度優選為1v/v％，Blocker的濃度優選為1v/v％。