[發(fā)明專利]一類促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病氧化應(yīng)激反應(yīng)細(xì)胞模型建立的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210047679.4
• 申請(qǐng)日: 2022-01-17
• 公開（公告）號(hào): CN114480282A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭玲;宋超;張洪江;李青宴;胡建英;董寶蓮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安寧市第一人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/079
• 分類號(hào): C12N5/079
• 代理公司: 北京挺立專利事務(wù)所(普通合伙) 11265
• 代理人: 葉盛

1.一類促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病氧化應(yīng)激反應(yīng)模型建立的方法，其特征在于如下步驟：

(1)原代小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)：以大鼠乳鼠為例，取2-3d齡SD大鼠，麻醉，斷頭，取大腦皮層，切碎后與0.25％胰酶孵育消化25min，加入等量培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打成為細(xì)胞懸液，分別使用100μm和40μm細(xì)胞篩過濾，離心，棄上清，加入培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并混勻，接種到T75培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10d；當(dāng)混合膠質(zhì)細(xì)胞融合，通過生物搖床分離小膠質(zhì)細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液后離心，棄上清，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，獲得2.5x10⁵cells/ml細(xì)胞懸液，以0.5ml/well接種至24-well細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置30min，更換為含5ng/ml M-CSF的培養(yǎng)基后，繼續(xù)37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育約24h即可開展實(shí)驗(yàn)；

(2)實(shí)驗(yàn)分組：step1 Control組，IL-1β組使用0-20ng/ml的IL-1β，TNF-α組使用0-200ng/ml的TNF-α，觀察16h其濃度依賴關(guān)系；step2 Control組，IL-1β單獨(dú)組使用10ng/ml一個(gè)濃度，或TNF-α單獨(dú)組使用100ng/ml一個(gè)濃度；二者均各觀察6-36h產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)或炎癥反應(yīng)與時(shí)間的關(guān)系；

(3)用Griess Assay檢測細(xì)胞上清液中NO濃度：孵育結(jié)束后，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清，將上清樣本、標(biāo)準(zhǔn)液、空白對(duì)照各50μl放入96孔板，加入GriessⅠ和Ⅱ試劑各50μl混勻后室溫靜置10min，用酶標(biāo)儀在560nm波長下檢測吸光度值，最后用NaNO₂標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出NO濃度值；

(4)測定iNOS蛋白表達(dá)變化：選用Western BlottingAnalysis、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，仔細(xì)吸去細(xì)胞上清液后，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞；提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，確定上樣量；制備5％和10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠并按順序進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、1％牛血清白蛋白封閉1h；一抗選用iNOS抗體，iNOS抗體按照1:2000稀釋、β-actin抗體，β-actin抗體按照1:2500稀釋，在4℃下孵育過夜；次日用Tris-Buffered Saline and Tween 20(TBST)溶液洗膜3次后，室溫下孵育與一抗對(duì)應(yīng)的二抗2h；再用TBST溶液洗膜3次；使用Immobilon Western化學(xué)發(fā)光HRP底物顯影，用Bio-Rad ChemiDoc MP成像系統(tǒng)獲得結(jié)果。

(5)采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圖像采用Image J軟件進(jìn)行處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤mean±SEM表示；兩兩比較時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析；P0.05表示差異有顯著性*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病氧化應(yīng)激反應(yīng)細(xì)胞模型建立的方法，其特征在于：在步驟(1)中，所述的培養(yǎng)基由α-MEM或DMEM、10％胎牛血清和1％青鏈霉素組成。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病氧化應(yīng)激反應(yīng)細(xì)胞模型建立的方法，其特征在于：在步驟(1)中，促炎細(xì)胞因子為促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α。