[發(fā)明專(zhuān)利]一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的眼用凝膠及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210036909.7
• 申請(qǐng)日: 2022-01-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114425033A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡凱;郭蓉潔;王晨晨
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京鼓樓醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): A61K9/06
• 分類(lèi)號(hào): A61K9/06;A61K31/728;A61K35/28;A61K47/20;A61K47/32;A61K47/36;A61P27/02
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專(zhuān)利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進(jìn)

1.一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的眼用凝膠，其特征在于，由如下質(zhì)量濃度的原料組成：

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體0.3-5g/L，透明質(zhì)酸鈉1.2-2.5g/L，牛磺酸1-2g/L，卡波姆9402g/L，采用等滲調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)滲透壓至280-350mOsm/L；PH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)PH值至6-7.5，溶劑為生理鹽水。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的眼用凝膠，其特征在于，所述的外泌體為從人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中提取。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的眼用凝膠，其特征在于，PH調(diào)節(jié)劑為HCl和NaOH。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的眼用凝膠，其特征在于，等滲調(diào)節(jié)劑為NaCl。

5.一種如權(quán)利要求1-4所述的含有間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的眼用凝膠的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

第一步，細(xì)胞培養(yǎng)收集培養(yǎng)液：選擇3-7代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)至70%融合后，換為不含血清的純培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)，收集不含血清的純培養(yǎng)基，進(jìn)行梯度離心法獲得外泌體；

第二步，使用超速離心法進(jìn)行外泌體提取：取收集的細(xì)胞上清液為4℃，300g，5min離心，取上清繼續(xù)4℃，3000g，15min離心，接著取上清4℃，10000g，60min離心，取上清通過(guò)22μm濾器過(guò)濾，過(guò)濾后液體4℃，100000g，70min離心，沉淀即為外泌體，用PBS懸浮沉淀，再次4℃，100000g，70min離心，PBS懸浮沉淀，獲得外泌體溶液，-80℃長(zhǎng)期保存，用于后續(xù)眼用凝膠制備；

第三步，外泌體鑒定：使用透射電鏡觀(guān)察外泌體形態(tài)，NTA檢測(cè)外泌體粒徑；

第四步，配置器具的準(zhǔn)備：配置時(shí)使用的燒杯、玻璃棒、轉(zhuǎn)子等使用滅菌鍋滅菌，配置均在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，使用前超凈臺(tái)紫外線(xiàn)滅菌30min；

第五步，輔料配置：用生理鹽水溶解透明質(zhì)酸鈉，用生理鹽水溶解牛磺酸和卡波姆940，將透明質(zhì)酸鈉溶液加入牛磺酸和卡波姆940溶液中，邊加邊攪拌，最后加入生理鹽水配至50ml體系，測(cè)量PH，使用PH調(diào)節(jié)劑將PH調(diào)至6-7.5，100℃水浴滅菌，不停攪拌，加熱到樣品80℃，取出冷卻；

第六步，眼用凝膠配置：在超凈臺(tái)內(nèi)，將經(jīng)第五步處理的溶液和含有外泌體的溶液混合，得到含有外泌體的眼用凝膠，將眼用凝膠每2ml分裝，4℃保存。