[發明專利]一種響應爆炸物分子的新型啟動子元件的篩選和應用

有效

• 申請號: 202210035966.3
• 申請日: 2022-01-11
• 公開（公告）號: CN114480388B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 王兆寶;楊建明;馬冉;于曉彤;湯若昊;李美潔
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/70;C12N1/21;G01N21/64;C12R1/19
• 代理公司: 青島合創知識產權代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發明公開了一種響應爆炸物分子的新型啟動子元件的篩選和應用。所述啟動子元件來源于沼澤紅假單胞菌，是利用轉錄組學篩選得到，其具有SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.7所示的核苷酸序列，并通過定向進化優化所述啟動子元件，優化篩選得到的啟動子元件具有顯著提高2,4?DNT檢測靈敏度的能力，為篩選出其他高效誘導型啟動子提供了新的思路和方法。此外，本發明的篩選方法與傳統的篩選方法相比，目的性更強，篩選效率更高，且篩選出的新型啟動子提高了爆炸物檢測的準確性、安全性和效率。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種響應爆炸物分子的啟動子元件及其篩選方法和應用。

背景技術

爆炸物被廣泛用于軍事和民用目的，這不僅給沖突地區人員生命安全帶來威脅，而且還造成嚴重的土壤和水污染。2,4-二硝基甲苯(DNT)是炸藥TNT產生的氣相中的主要成分，因為其較高的揮發性能，常被用作檢測爆炸物存在的特征化學物質。以往爆炸物的檢測技術不允許遠程檢測，在檢測過程中會存在很大的危險性，因此Burlage等人提出了一種可能的生物解決方案，就是在目標區域散布基因工程微生物生物反應器，允許遠程定位爆炸物位置。目前已有研究人員進行了若干嘗試來開發感應2,4-DNT的生物傳感器，包括具有全細胞生物傳感器的體內系統和使用純化的蛋白質/肽的體外系統。目前，開發用于檢測DNT的生物傳感器的主要挑戰是實現高靈敏度和高選擇特異性。

沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas?palustris)是一種紫色非硫細菌(purplenon-sulfur?bacteria，PNSB)，在自然界中分布很廣泛，主要分布在光照充足的厭氧水環境中，它們既能在厭氧光照條件下以低級脂肪酸、多種二羧酸、醇類、糖類、芳香族化合物等低分子有機物作為光合作用的電子供體進行光能異養生長，又能在黑暗有氧條件下以有機物為呼吸基質進行好氧異養生長。假單胞菌屬是降解芳香族化合物最常見的微生物，它們憑借其獨有的生理特性，能夠在好氧和厭氧條件下降解多種芳香化合物，如芳香羧酸、硝基苯酚、偶氮苯類等，說明該菌株基因組含有可高效感應芳香族化合物分子的相關啟動子元件。然而目前并無有關利用2,4-DNT刺激沼澤紅假單胞菌，分析基因轉錄組學變化篩選高效感應TNT或DNT分子的啟動子元件的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種響應爆炸物分子的啟動子元件及其篩選方法和應用。本發明通過利用爆炸物分子刺激光合細菌后其轉錄組的變化，篩選到高效感應爆炸物分子的啟動子元件，并通過定向進化優化該啟動子元件，最終得到的啟動子元件具有顯著提高2,4-DNT檢測靈敏度的能力。

為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

本發明提供了一種響應爆炸物分子的啟動子元件，所述啟動子元件具有下列核苷酸序列之一：

(1)如SEQ?ID?NO.4所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ?ID?NO.7所示的核苷酸序列。

進一步的，所述啟動子元件來源于沼澤紅假單胞菌，是利用轉錄組學篩選得到。

進一步的，依據轉錄組學篩選到的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示的啟動子元件能夠以高靈敏度響應爆炸物分子。

進一步的，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的定向進化優化后的啟動子元件的響應爆炸物分子的靈敏度較未優化的啟動子元件顯著提高。

本發明還提供了所述的響應爆炸物分子的啟動子元件的篩選方法，包括以下步驟：

(1)利用含爆炸物分子的溶液刺激沼澤紅假單胞菌，提取刺激后的沼澤紅假單胞菌的RNA進行轉錄組學分析，找到出現上調或下調情況的基因；

(2)預測步驟(1)中基因的啟動子序列；并以沼澤紅假單胞菌的基因組為模板擴增獲得基因的啟動子序列；