[發(fā)明專利]一種RcFAH12基因啟動子和其缺失突變體及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210035409.1
• 申請日: 2022-01-13
• 公開（公告）號: CN114317540B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發(fā)明（設計）人: 狄建軍;張立軍;黃鳳蘭;陳永勝;李國瑞;何智彪;王丹;李瑞英;張春玲;趙華洋;羅蕊;趙永;韓雯毓;王冬艷
• 申請（專利權）人: 內蒙古民族大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/84;C12N15/65;A01H5/10;A01H5/02;A01H5/12;A01H6/20
• 代理公司: 北京中北知識產(chǎn)權代理有限公司 11253
• 代理人: 楊亞潔

本發(fā)明公開了一種2605bp長的RcFAH12啟動子及其缺失突變片段，所述RcFAH12啟動子及缺失突變片段的獲得方法包括以下步驟：將全基因合成的RcFAH12啟動子?2506～+99bp序列，連入pUC57質粒載體中得到質粒pUC57?RcFAHP2605，并以質粒pUC57?RcFAHP2605為模板，分別以對應的T/B引物對進行PCR擴增，得到10個啟動子缺失突變片段，經(jīng)PCR擴增、純化、連接，成功構建含不同RcFAH12基因啟動子缺失克隆的表達載體，并通過擬南芥遺傳轉化，利用農(nóng)桿菌介導的蘸花法侵染擬南芥，得到T3代轉基因擬南芥，對T3代轉基因擬南芥組織進行GUS染色分析，得出不同長度的RcFAH12基因啟動子表現(xiàn)出不同的啟動表達活性，包括具有組成型啟動表達、種子相對特異性表達、花粉特異性表達，在植物基因工程育種中具有重要應用價值。

技術領域

本發(fā)明屬于植物生物工程育種和分子生物學技術領域，具體涉及一種RcFAH12基因啟動子和其缺失突變體及其應用。

背景技術

蓖麻(Ricinus?communis?L.)是一種大戟科二倍體(x＝10，2n＝20)油料植物，其種子中含有39.6％～59.5％的甘油三酯，其中一種特殊的羥化脂肪酸——蓖麻醇酸酯(Ricinoleate)，也稱蓖麻油酸(18:1-OH；12-hydroxy-9-cis-octadecenoic?acid)約占總脂肪酸的81.44％～90.25％，其比例與種子發(fā)育時間正相關。催化蓖麻油酸生物合成的關鍵酶是油酸-12-羥化酶(oleate?12-hydroxylase,RcFAH12)，屬于脂肪酸修飾酶，能將磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)的Sn-2-油酰基轉變?yōu)镾n-2-蓖麻油酰基。是蓖麻油中產(chǎn)生高蓖麻油酸的重要原因。

基因啟動子的研究對于理解基因表達調控至關重要，分離的啟動子序列及其元件對基因的精細調節(jié)也至關重要。不同的啟動子使基因具有不同的表達特性。選擇合適的啟動子對于外源基因的表達量至關重要。能夠使基因在大多數(shù)的細胞類型中表達的啟動子稱為組成型啟動子，如對許多雙子葉植物轉基因工作而言，最常用的一種啟動子是來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子。它們是植物基因工程中應用最早、最廣泛的一類啟動子，特點是表達具有持續(xù)性，表達量基本恒定，也正由于這種特點使得外源基因產(chǎn)物可能對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響，甚至導致死亡。此外，重復使用同一種啟動子驅動兩個或兩個以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象。為了使外源基因在植物體內高效發(fā)揮作用，同時又可減少對植物的不利影響，使人們越發(fā)注重特異表達啟動子和誘導型啟動子的研究和應用，使啟動子在特定的組織和一定的發(fā)育時期啟動基因表達，使基因表達能夠對特異條件產(chǎn)生響應，既保證了外源基因在植物體內的有效發(fā)揮又減少了對植物的不良影響。目前，大量的特異性啟動子和誘導型啟動子已被克隆和功能分析，并已廣泛應用于植物基因工程中。

發(fā)明內容

本發(fā)明利用RACE技術，確定RcFAH12基因轉錄起點位置，得到啟動子及其缺失片段，并進一步的將缺失片段轉化到擬南芥中，得到該基因缺失片段啟動基因表達的模式，提供了一種來源于蓖麻的RcFAH12基因啟動子和其缺失突變片段及應用。

一種RcFAH12啟動子，所述RcFAH12啟動子是利用RACE技術確定RcFAH12轉錄起始位點，參照蓖麻基因組序列合成的RcFAH12啟動子-2506～+99bp序列。本發(fā)明還公開了一種RcFAH12啟動子的缺失突變片段，所述RcFAH12啟動子及缺失突變片段的獲得方法包括以下步驟：將RcFAH12啟動子-2506～+99bp序列，連入pUC57質粒載體中得到質粒pUC57-RcFAHP2605，并以質粒pUC57-RcFAHP2605為模板，分別以對應的T/B引物對進行PCR擴增，得到10個啟動子缺失突變片段。