[發明專利]構建啟動子文庫的方法

在審

• 申請號: 202210029814.2
• 申請日: 2022-01-12
• 公開（公告）號: CN114908426A
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 劉亞菲;費一諾;耿文鑫;曹根霞;劉沛銘
• 申請（專利權）人: 常州藥物研究所有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12N15/113;C12N15/78;G16B30/00
• 代理公司: 常州市權航專利代理有限公司 32280
• 代理人: 趙慧

1.一種構建啟動子文庫的方法，其特征在于，包括：

獲取基因組序列和序列注釋；

根據序列注釋設置啟動子位置信息；

根據啟動子位置信息進行篩選，獲取啟動子序列以構建啟動子文庫；

根據啟動子序列設計用于一步克隆法連接的引物；

根據引物獲得啟動子片段；

根據啟動子片段構建重組載體；

對重組載體轉化并提取質粒；以及

將質粒轉化后獲得不同強度的啟動子。

2.如權利要求1所述的構建啟動子文庫的方法，其特征在于，

所述獲取基因組序列和序列注釋的方法包括：

銅綠假單胞菌PAO1的基因組序列文件和序列注釋文件。

3.如權利要求2所述的構建啟動子文庫的方法，其特征在于，

所述根據序列注釋設置啟動子位置信息的方法包括：

對于正義鏈，基因CDS起始位置-500作為啟動子的起始位置；

對于反義鏈，基因CDS起始位置+500作為啟動子的起始位置。

4.如權利要求3所述的構建啟動子文庫的方法，其特征在于，

所述根據啟動子位置信息進行篩選，獲取啟動子序列以構建啟動子文庫的方法包括：

輸入啟動子位置信息，輸入啟動子motif序列：

TGACANNNNNNNNNNNNNNNNNNTATAA；

其中N的數量為15～18；

設置p值10^-6，在保證足夠篩選量的前提下優先選擇更低p值對應的啟動子序列進行啟動子文庫的構建。

5.如權利要求4所述的構建啟動子文庫的方法，其特征在于，

所述根據引物獲得啟動子片段的方法包括：

使用引物，通過PCR擴增，擴增獲得啟動子片段。

6.如權利要求5所述的構建啟動子文庫的方法，其特征在于，

所述根據啟動子片段構建重組載體的方法包括：

將啟動子片段與表達載體pUCP18E連接，構建重組載體。

7.如權利要求6所述的構建啟動子文庫的方法，其特征在于，

所述對重組載體轉化并提取質粒的方法包括：

將重組載體轉化大腸桿菌并提取質粒。

8.如權利要求7所述的構建啟動子文庫的方法，其特征在于，

所述將質粒轉化后獲得不同強度的啟動子的方法包括：

將質粒依次轉化至銅綠假單胞菌PAO1感受態細胞，發酵培養后通過測定熒光強度獲得不同強度的啟動子。

9.如權利要求1所述的構建啟動子文庫的方法，其特征在于，

所述引物的序列如SEQ ID No.11～30中任一所示。

10.如權利要求1所述的構建啟動子文庫的方法，其特征在于，

所述啟動子序列如SEQ ID No.1～10所示。